POPULASI, IDENTIFIKASI DAN DETEKSI FRAGMEN GEN PENGHASIL AFLATOKSIN ASPERGILLUS FLAVUS PADA KACANG TANAH DAN PRODUK OLAHANNYA KEMALA S. NAGUR SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Populasi, Identifikasi dan Deteksi Fragmen Gen Penghasil Aflatoksin Aspergillus flavus pada Kacang Tanah dan Produk Olahannya adalah benar karya saya bersama dengan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Agustus 2014 Kemala S. Nagur NIM G351110011
RINGKASAN KEMALA S. NAGUR. Populasi, Identifikasi dan Deteksi Fragmen Gen Penghasil Aflatoksin Aspergillus flavus pada Kacang Tanah dan Produk Olahannya. Dibimbing oleh NAMPIAH SUKARNO dan SRI LISTIYOWATI. Aspergillus flavus merupakan spesies cendawan utama yang menghasilkan aflatoksin. Keberadaan cendawan ini dan aflatoksinnya pada bahan pangan menjadi masalah utama pada keamanan pangan. Penelitian ini bertujuan untuk menghitung populasi dan mengidentifikasi A. flavus dari biji kacang tanah dan produk olahannya, mendeteksi empat macam gen biosintesis aflatoksin dan produksi aflatoksinnya secara kualitatif, dan analisis filogenetik berdasarkan sekuen omt-1. Metode isolasi terlebih dahulu distandarisasi menggunakan kultur standar A. flavus 747 pada biji kacang tanah dengan parameter penghitungan nilai presisi, akurasi, limit deteksi dan limit kuantitasi. Sampel biji kacang tanah, kacang atom, kacang garing dan bumbu pecel diambil dari pasar tradisional di daerah Bogor, Depok dan Jakarta. Isolasi cendawan dilakukan menggunakan medium spesifik Aspergillus flavus parasiticus Agar. Identifikasi cendawan dilakukan berdasarkan morfologi dan molekuler menggunakan primer spesifik spesies, yaitu FVAVIQ1/FLAQ2 dan AFLA-F/AFLA-R. Deteksi bagian dari gen yang terlibat dalam biosintesis aflatoksin menggunakan 4 pasang primer, yaitu apa-2, nor-1, ver-1 dan omt-1. Produksi aflatoksin dideteksi dengan menumbuhkan isolat di media Coconut Agar Medium pada umur kultur 5 hari yang dipaparkan sinar UV dengan panjang gelombang 365 nm. Analisis pohon filogenetik dilakukan terhadap 3 perwakilan isolat menggunakan software Mega 5 dengan metode Neighbor Joining dan model Kimura 2-paramater serta bootsrap 1000 kali. Hasil uji standarisasi metode isolasi A. flavus menunjukkan bahwa metode yang digunakan memenuhi persyaratan. Populasi A. flavus 747 pada semua ampul yang diuji homogen dan stabil, dengan nilai akurasi 97.04-100%, presisi 1.1-1.9%, limit deteksi 50 cfu/ml dan limit kuantitasi 120 cfu/ml. Hasil isolasi menunjukkan bahwa pada 36 sampel yang diuji, cendawan kelompok A. flavus hanya ditemukan pada biji kacang tanah dengan populasi sebanyak 0.01-5.52 x 10 4 cfu/g, dan tidak ditemukan pada produk olahannya. Sebanyak 18 isolat yang diperoleh diidentifikasi sebagai spesies A. flavus berdasarkan karakteristik morfologi dan molekuler dengan primer spesifik spesies menghasilkan amplikon berukuran sekitar 100 dan 413 bp. Hasil deteksi dengan 4 primer dari gen biosintesis aflatoksin menunjukkan bahwa semua isolat dapat teramplifikasi oleh primer apa-2 dan nor-1, 15 isolat teramplifikasi oleh primer omt-1 dan 13 isolat teramplifikasi oleh primer ver-1 yang secara berturut-turut menghasilkan ukuran amplikon sekitar 1032, 400, 895 dan 1024 bp. Sebanyak 3 dari 18 isolat yang tidak menghasilkan amplikon omt-1 tidak menghasilkan aflatoksin karena tidak berpendar di bawah paparan sinar UV. Hasil analisis pohon filogenetik menunjukkan bahwa isolat A. flavus B1 dan B2 yang toksigenik asal Bogor berada pada cabang yang terpisah dengan isolat A. flavus D1 asal Depok yang juga toksigenik.. Kata kunci: Aspergillus flavus, gen biosintesis aflatoksin, kacang tanah, primer spesifik, sekuen omt-1
SUMMARY KEMALA S. NAGUR. Population, Identification and Detection of Aflatoxin Producer Gene Fragment of Aspergillus flavus in Peanut and Peanut Products. Supervised by NAMPIAH SUKARNO dan SRI LISTIYOWATI. Aspergillus flavus is a main fungus that is able to produce aflatoxin. The presence of this fungus and its aflatoxin causing serious problem on food safety. This research aimed to isolate and identify A. flavus from peanut and its processed products, detection of their aflatoxin biosynthesis genes, qualitative test of aflatoxin production and analysis of phylogenetic tree based on sequences of omt-1 aflatoxin gene. Sample of peanut, roasted peanuts with skin pod, flour-coated peanuts, and bumbu pecel (dry peanut sauce) were collected from traditional markets in Bogor, Depok and Jakarta. Fungal isolation was carried out using Aspergillus flavusparasiticus Agar specific medium whereas fungal identification was conducted by combining morphological and molecular analysis using two pairs of species specific primers FVAVIQ1/FLAQ2 and AFLA-F/AFLA-R. Detection of aflatoxin genes employed four specific primers of apa-2, nor-1, ver-1 and omt-1. Aflatoxin production of A. flavus determined by observation of fluorescence under UV light on Coconut Agar Medium. The phylogenetic tree of 3 isolates based on omt-1 sequence was done by using MEGA 5 program with Neighbor Joining method, Kimura 2-parameter model and 1000 bootstrap replications. The result of standardization method using A. flavus 747 shows that the method was fulfill the requirements, population of A. flavus 747 in all ampoules was homogenous and stabile, the accuration value was 97.04-100%, precision value was 1.1-1.9%, limit of detection was 50 cfu/ml and limit quantification was 120 cfu/ml. The total 18 isolates of Aspergillus isolated from 36 samples. All the 18 isolates were derived from peanut with colony count range 0.01-5.52 x 10 4 cfu/g. There was no A. flavus isolate derived from peanut processed products. Further molecular analysis indicated that all of 18 isolates were A. flavus. This indicated by PCR amplicons having 100 and 413 bp for FVAVIQ1/FLAQ2 primers and AFLA-F/AFLA-R primers respectively. Based on aflatoxin gene analysis showed that all 18 isolates were successfully amplified by both apa-2 and nor-1 primer, 15 isolates amplified by omt-1 and 13 isolates amplified by ver-1 primer. The amplicon size of apa-2, nor-1, ver-1 and omt-1 primer pairs were about 1032, 400, 895 and 1024 bp, respectively. Three out of 18 isolates did not produce fluorescence under UV light. This indicated that isolates were not aflatoxin producer. Based on phylogenetic tree indicated that toxigenic A. flavus B1 and B2 originated from Bogor were located in different clade with toxigenic A. flavus D1 originated from Depok. Key words: Aspergillus flavus, aflatoxin biosynthesis genes, omt-1 sequence, peanut, specific primer
Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
POPULASI, IDENTIFIKASI DAN DETEKSI GEN PENGHASIL AFLATOKSIN ASPERGILLUS FLAVUS PADA KACANG TANAH DAN PRODUK OLAHANNYA KEMALA S. NAGUR Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Mikrobiologi SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
Penguji luar komisi pada ujian tesis: Dr Ir Utut Widyastuti, MSi
Judul Tesis : Populasi, Identifikasi dan Deteksi Fragmen Gen Penghasil Aflatoksin Aspergillus flavus pada Kacang Tanah dan Produk Olahannya Nama : Kemala S. Nagur NIM : G351110011 Disetujui oleh Komisi Pembimbing Dr Ir Nampiah Sukarno Ketua Dr Sri Listiyowati, MSi Anggota Diketahui oleh Ketua Program Studi Mikrobiologi Dekan Sekolah Pascasarjana Prof Dr Anja Meryandini, MS Dr Ir Dahrul Syah, MSc Agr Tanggal Ujian: Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta ala atas segala karunia-nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Desember 2012 sampai Mei 2014 ini ialah cendawan Aspergillus flavus, dengan judul Populasi, Identifikasi dan Deteksi Fragmen Gen Penghasil Aflatoksin Aspergillus flavus pada Produk Kacang Tanah. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr Ir Nampiah Sukarno dan Ibu Dr Sri Listiyowati MSi selaku pembimbing, serta Ibu Prof Okky Setyawati Dharmaputra yang telah banyak memberi saran dan bantuan. Penulis juga menyampaikan penghargaan kepada staf dan rekan-rekan di Laboratorium IPBCC, Laboratorium Mikologi Departemen Biologi Fakultas MIPA IPB dan Laboratorium pengujian SEAMEO BIOTROP Bogor yang telah membantu selama penelitian. Terima kasih juga diungkapkan kepada rekan-rekan seperjuangan angkatan 2011 Program Studi Mikrobiologi (Isra, Ayu, ibu Tatik, Sari, Lisma, Tri, ibu Elly, Ivan, Eris, dan Nicho). Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada almarhum ayah Suardi Nagur, mama Marwanis, mama Dewi Ratna Nasution, adik-adik Malvina S. Nagur, Muharni S. Nagur, Rivki Suardi dan kepada suami tercinta M. Halomoan Rangkuti, anak tersayang Maulana Al Farabi, serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Agustus 2014 Kemala S. Nagur
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN 1 PENDAHULUAN 1 2 TINJAUAN PUSTAKA Aspergillus flavus 3 Identifikasi Aspergillus flavus secara Morfologi dan Molekuler 4 Aflatoksin 5 Biosintesis Aflatoksin 6 Kacang Tanah 9 Preservasi Cendawan 10 Parameter Kesesuaian Kinerja Metode 11 3 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian 11 Bahan dan Alat 11 Standarisasi Metode Uji 13 Isolasi dan Penghitungan Populasi Aspergillus flavus dari sampel menggunakan Metode Terstandarisasi 15 Identifikasi Isolat asal Bogor, Depok dan Jakarta secara Morfologi dan Molekuler 16 Deteksi Gen Biosintesis Aflatoksin dan Uji Kualitatif Produksi Aflatoksin 17 Sekuensing dan Analisis Pohon Filogenetik 18 4 HASIL Standarisasi Metode Uji 18 Isolasi dan Penghitungan Populasi Aspergillus flavus dari sampel menggunakan Metode Terstandarisasi 20 Identifikasi Isolat asal Bogor, Depok dan Jakarta secara Morfologi dan Molekuler 21 Deteksi Gen Biosintesis Aflatoksin dan Uji Kualitatif Produksi Aflatoksin 23 Analisis Pohon Filogenetik 26 5 PEMBAHASAN Standarisasi Metode Uji 26 Isolasi dan Penghitungan Populasi Aspergillus flavus dari sampel menggunakan Metode Terstandarisasi 27 Identifikasi Isolat asal Bogor, Depok dan Jakarta secara Morfologi dan Molekuler 28 Deteksi Gen Biosintesis Aflatoksin dan Uji Kualitatif Produksi Aflatoksin 29 Analisis Pohon Filogenetik 30 v vi vi
6 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan 31 Saran 32 DAFTAR PUSTAKA 32 LAMPIRAN 39 RIWAYAT HIDUP 45
DAFTAR TABEL 1 Gen biosintesis aflatoksin 9 2 Primer spesifik untuk identifikasi Aspergillus flavus 17 3 Primer spesifik untuk deteksi fragmen gen biosintesis aflatoksin 17 4 Jumlah koloni A. flavus 747 hasil preservasi 3 hari dan 4 minggu 18 5 Nilai presisi (RSD) dan akurasi (recovery) populasi Aspergillus flavus 747 19 6 Jumlah koloni Aspergillus flavus 747 untuk limit deteksi 20 7 Parameter uji, kriteria keberterimaan dan hasil perhitungan uji standarisasi metode 20 8 Hasil isolasi cendawan pada biji kacang tanah dari pasar tradisional di Bogor, Depok, dan Jakarta 21 9 Hasil isolasi cendawan pada produk olahan kacang tanah dari pasar tradisional di Bogor, Depok, dan Jakarta 10 Ukuran karakter morfologi isolat Aspergillus flavus 21 11 Hasil amplifikasi primer apa-2, nor-1, ver-1, dan omt-1 pada isolat 18 isolat Aspergillus flavus 24 DAFTAR GAMBAR 1 Skema sederhana pembentukan aflatoksin 7 2 Jalur kompleks biosintesis aflatoksin berserta nama gen dan enzim yang terlibat dalam setiap tahapan 8 3 Alur penelitian 12 4 Hubungan antara 10 log jumlah Aspergillus flavus 747 dari sampel positif dengan kontrol positif 19 5 Penampakan makroskopis dan mikroskopis isolat Aspergillus flavus 22 6 Amplikon primer FVAVIQ1/FLAQ2 dan AFLA-F/AFLA-R pada 18 sampel 23 7 Amplikon primer FVAVIQ1/FLAQ2 dan AFLA-F/AFLA-R pada kultur standar 23 8 Amplikon primer apa-2, nor-1, ver-1 dan omt-1 pada 18 sampel 24 9 Amplikon primer apa-2, nor-1, ver-1 dan omt-1 pada kultur standar 25 10 Deteksi produksi aflatoksin pada medium CAM di bawah sinar UV 365 nm 25 11 Pohon filogenetik isolat toksigenik Aspergillus flavus B1, B2, dan D1 berdasarkan sekuens omt-1 dengan software Mega 5 metode Neighbor Joining model Kimura 2-parameter 26
DAFTAR LAMPIRAN 1 Data uji homogenitas 38 2 Data uji stabilitas 39 3 Jumlah koloni pada sampel positif dan kontrol positif 5 kali ulangan 40 4 Kuantitas dan kemurnian hasil ekstraksi DNA isolat cendawan 41 5 Penampakan mikroskopis isolat Aspergillus flavus dari sampel 42 6 Komposisi media per liter 43