9 3. METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April sampai dengan Agustus 2012, bertempat di Laboratorium Kesehatan Ikan dan Laboratorium Nutrisi Ikan, serta di kolam percobaan Babakan Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Tahapan Penelitian Penelitian dilaksanakan dalam 2 tahap, yaitu: 1. Penelitian tahap I Bertujuan untuk menentukan dosis enzim kasar kitinase optimum untuk mereduksi kandungan kitin dari tepung cangkang udang. Tahap penelitian ini terdiri dari beberapa subbab penelitian, yaitu: 1). Kultur bakteri Serratia marcescens, 2). Hidrolisis kitin dengan beberapa dosis enzim dengan waktu inkubasi 12 dan 24 jam. Hasil yang terbaik akan digunakan untuk penelitian tahap II. 2. Penelitian tahap II Bertujuan untuk mengaplikasikan tepung cangkang udang dengan dosis enzim kasar kitinase terbaik dalam pakan ikan patin dengan melihat nilai kecernaan bahan baku, laju pertumbuhan harian, efisiensi pakan, retensi protein dan retensi lemak ikan patin. Prosedur Penelitian a. Tahap I 1. Kultur bakteri Serratia marcescens dan produksi enzim kasar kitinase Biakan bakteri diambil sebanyak 1 ose secara aseptis, kemudian digoreskan kedalam cawan petri steril yang telah berisi TSA, lalu diinkubasi dalam alat inkubator dengan suhu 37 0 C selama 18-24 jam. Bakteri Serratia marcescens yang diperoleh dikultur dalam media TSA di cawan petri selama 18 24 jam kemudian sebanyak 2 lup dimasukkan kedalam 100ml TSB selama 60 jam pada suhu 30 0 C menggunakan tabung erlenmeyer dengan kecepatan shaker 120 rpm. Enzim kasar kitinase dipisahkan dari bakteri dengan dipusingkan (sentrifugasi) pada 10.000 rpm selama 15 menit (Natarajan dan Murty 2010). Supernatant yang mengandung enzim kasar kitinase dipindahkan ke dalam botol kaca dan disimpan dalam kulkas sampai saat digunakan. Sedangkan endapan yang berisi sel sel bakteri dimusnahkan dengan membuangnya pada air mengalir dan wadah dicuci bersih. Untuk uji pertumbuhan bakteri dan uji aktivitas enzimatik, bakteri Serratia marcescens yang telah dikultur dimedia TSA dalam cawan petri diambil sebanyak 2 lup dan dimasukkan kedalam tabung erlenmeyer berisi media TSB untuk dishake selama 72 jam. Bakteri kemudian diambil sebanyak 10ml dengan rentang waktu per 3 jam untuk diuji pertumbuhannya dan 10ml dengan rentang waktu per 24 jam untuk diuji aktivitas enzimatiknya (Lampiran 2).
10 Parameter yang diamati dalam percobaan ini adalah analisa aktivitas enzim kasar kitinase dengan menggunakan metode Hong et al. (1989) (Lampiran 2), menganalisa pertumbuhan dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 600nm untuk menghitung optical density (OD) dari konsentrasi biomassa. 2. Hidrolisis kandungan kitin dalam tepung cangkang udang menggunakan enzim kasar kitinase Proses hidrolisis tepung cangkang udang dilakukan dengan menginkubasi tepung cangkang udang dengan enzim kasar kitinase dengan lama waktu inkubasi selama 12 dan 24 jam. Penelitian ini dilakukan secara eksperimen dengan perlakuan dosis enzim 2 unit enzim/100gr tepung, 3 unit enzim/100gr tepung, 4 unit enzim/100gr tepung, 5 unit enzim/100gr tepung. Enzim kasar kitinase diberikan kedalam wadah berisi tepung cangkang udang menggunakan sprayer sambil diaduk sedikit demi sedikit. Setelah lama inkubasi terpenuhi, wadah yang berisi tepung cangkang udang dimasukkan kedalam freezer untuk menghentikan kerja enzim kasar kitinase. Parameter yang diamati dalam percobaan ini adalah menganalisa kandungan kitin (Lampiran 3), menganalisa kandungan nutrisi TCU (kadar air, kadar protein, serat kasar, kadar lemak, BETN) dengan menggunakan metode proximat (Lampiran 1), serta menganalisa kandungan asam amino dari TCU dengan menggunakan HPLC (Lampiran 4). b. Tahap II 1. Uji kecernaan bahan baku terhadap ikan patin Ikan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan patin (Pangasius sp.) dengan bobot rata rata 0,82 ± 0,04 gr. Sedangkan wadah pemeliharaan yang digunakan adalah akuarium berukuran 50 x 50 x 60 cm. Volume air dalam akuarium adalah 90 liter. Pada masing masing akuarium diberi aerasi dan heater. Air yang digunakan dalam penelitian berasal dari sumur, kemudian ditampung dalam bak penampungan dan diaerasi. Pemberian aerasi dimaksudkan untuk memperkaya kandungan oksigen dalam air. Pakan perlakuan digunakan untuk uji kecernaan terdiri dari pakan acuan (Noegroho, 2000) dan pakan campuran bahan uji dengan perbandingan 70% pakan acuan dan 30% bahan uji. Pakan diberi kromium trioksida (Cr 2 O 3 ) sebagai marker sebesar 0,5% w/w (NRC 1993). Komposisi pakan acuan dan pakan uji ditunjukkan pada Tabel 4. Analisa proximat pada pakan uji dan pakan acuan disajikan pada Tabel 5.
11 Tabel 4. Komposisi pakan referensi (Noegroho 2000) dan pakan uji (%) Pakan Referensi Pakan Uji TCU TCUh Tepung Ikan 50,92 35,64 35,64 Tepung Terigu 32,28 22,60 22,60 Minyak Ikan 7,4 5,18 5,18 Vitamin 1,4 0,98 0,98 Mineral 5 3,50 3,50 CMC 2,5 1,75 1,75 Cr 2 O 3 0,5 0,35 0,35 Bahan Uji - 30 30 Total 100 100 100 Tabel 5. Komposisi proximat pakan uji kecernaan (%bobot kering) Pakan Referensi Pakan Uji TCUh TCU Kadar air 4,08 5,71 6,64 Protein kasar 32,15 31,66 28,56 Lemak kasar 9,43 11,71 8,66 Kadar abu 20,33 16,41 20,16 Serat kasar 6,73 0,46 6,48 BETN 27,28 34,05 29,5 C/P 8,00 9,18 8,54 Pemberian pakan perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali sehari (pukul 08.00, 12.00 dan 16.00) at satiation. Pengumpulan feses mulai dilakukan satu jam setelah pemberian pakan uji dengan asumsi pakan sudah tercerna oleh ikan dalam waktu 1 jam. Feses diambil satu jam setelah pemberian pakan dengan mengangkat selang aerasi dalam wadah pemeliharaan agar feses tidak teraduk didalam air. Setelah ±10 menit setelah selang aerasi diangkat, feses diambil dengan cara penyiphonan dan ditampung didalam gayung. Pemindahan feses dari wadah penampung ke dalam botol sampel dilakukan secara perlahan agar kromium yang terkandung didalam feses tidak larut ke media air. Setelah itu, feses dipindahkan ke botol sampel dan disimpan dalam freezer. Parameter Pengamatan Parameter yang diamati adalah nilai kecernaan protein dan nilai kecernaan total dihitung menggunakan rumus sebagai berikut (Takeuchi 1988):
12 a = % Cr 2 O 3 dalam pakan a = % Cr 2 O 3 dalam feses b = % protein dalam pakan b = % protein dalam feses n = mg Cr 2 O 3 /g pakan n = mg Cr 2 O 3 /g pakan Analisa Data Data yang akan diperoleh kemudian ditabulasi dan dianalisa mengunakan program Excel MS Office 2007 dan untuk uji ANOVA dianalisis menggunakan program Minitab 16. Perlakuan yang berbeda akan diuji lanjut menggunakan uji Duncan. 2. Pengaruh pemberian tepung cangkang udang yang dihidrolisis terhadap pertumbuhan ikan patin Ikan yang digunakan pada penelitian ini adalah ikan patin (Pangasius sp.) dengan bobot rata rata 0,82 ± 0,04 gr sebanyak 90 ekor/akuarium. Sedangkan wadah pemeliharaan yang digunakan adalah akuarium berukuran 50 x 50 x 60 cm. Jumlah akuarium yang digunakan adalah 12 unit akuarium untuk 4 perlakuan dan 3 ulangan dengan sistem resirkulasi. Volume air dalam akuarium adalah 90 liter. Pada masing masing akuarium diberi aerasi dan heater. Pemberian aerasi dimaksudkan untuk memperkaya kandungan oksigen dalam air. Sedangkan heater digunakan untuk mengatur suhu dalam air. Sebelum perlakuan, ikan diadaptasi ikan selama satu minggu. Setelah masa adaptasi selesai, ikan dipuasakan selama 24 jam untuk menghilangkan sisa pakan didalam saluran pencernaan dan ikan ditimbang bobotnya dan dimasukkan kedalam wadah pemeliharaan. Pakan uji menggunakan tepung ikan (TI), MBM (meat bone meal) dan tepung cangkang udang yang dihidrolisis (TCUh), tepung kedelai (TK) dan tepung jagung (TJ), minyak kelapa, tepung tapioka sebagai perekat (binder) dan vitamin mineral mix. Sebelum digunakan, bahan bahan ini diuji kandungan nutrisinya dengan analisa proksimat. Kandungan protein dalam pakan uji adalah 30% dengan energi/protein pakan sebesar 8kkal/gr. Penelitian ini menggunakan tepung cangkang udang yang dihidrolisis untuk menggantikan keberadaan tepung ikan dalam pakan. Adapun dosis TCUh dalam pakan uji adalah sebagai berikut 0%, 15%, 30% dan 45%. Pakan uji dibuat dengan mencampurkan seluruh bahan bahan dan diaduk hingga merata. Pakan lalu dicetak dan dikeringkan. Setelah itu, pakan disimpan ditempat yang kering dan tidak lembab. Pakan yang telah dibuat dianalisa proksimat untuk melihat apakah target protein, energi pakan dan energi protein rasio terlah terpenuhi atau tidak. Formulasi pakan pada setiap
13 perlakuan ditunjukkan pada Tabel 6 dengan analisa proximat masing masing perlakuan pada Tabel 7. Pemberian pakan perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali sehari (pukul 08.00, 12.00 dan 16.00) at satiation. Pengelolaan kualitas air dilakukan dengan pengecekan kualitas air setiap minggu pada masa pemeliharaan. Tabel 6. Komposisi pakan penelitian A (100% TI) B (15% TCUh:85% TI) Perlakuan C (30% TCUh:70% TI) D (45% TCUh:55% TI) Tepung Ikan 17,40 14,79 12,18 9,57 TCUh 1) 0,00 2,61 5,22 7,83 MBM 2) 17,40 17,40 17,40 17,40 Tepung Jagung 26,78 26,78 26,78 26,78 Tepung Kedelai 26,78 26,78 26,78 26,78 Minyak Sawit 3,76 3,76 3,76 3,76 Premix 3) 1,88 1,88 1,88 1,88 Tapioka 6,00 6,00 6,00 6,00 1) TCUh: Tepung Cangkang Udang Terhidrolisis Enzim Kasar Kitinase 2) MBM: Meat Bone Meal 3) Komposisi premix (vitamin mineral mix dapat dilihat pada Lampiran 2) Tabel 7. Komposisi proximat pakan uji (%bobot kering) dan energi Perlakuan A (100% TI) B (15% TCUh:85% TI) C (30% TCUh:70% TI) D (45% TCUh:55% TI) Kadar air 7,76 8,89 9,81 6,74 Protein kasar 32,94 31,82 32,63 31,39 Lemak kasar 6,13 5,43 6,21 5,09 Kadar abu 11,97 12,06 11,91 12,09 Serat kasar 4,82 1,92 2,08 2,55 BETN 1) 36,38 39,88 37,36 42,14 DE (kkal/g) 2) 7,77 8,02 7,90 8,17 1) BETN: Bahan Ekstrak Tanpa Nitrogen 2) DE: Digestible Energy 1 gram protein = 3,5 kkal DE, 1 gram lemak = 8,1 kkal DE, 1 gram karbohidrat/betn = 2,5 kkal DE (NRC, 1993)
14 Parameter Pengamatan Peubah yang akan diamati dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: a. Laju Pertumbuhan Harian Laju pertumbuhan harian dihitung dengan menggunakan rumus (Huisman et al 1991): Wt = bobot rata rata individu pada waktu t (g) Wo = bobot rata rata individu pada waktu awal (g) α = laju pertumbuhan harian individu (%) t = waktu pemeliharaan (hari) b. Jumlah Konsumsi pakan Jumlah pakan yang diberikan setiap hari selama masa pemeliharaan dikurangi jumlah pakan yang tersisa pada akhir masa pemeliharaan. c. Efisiensi pakan Efisiensi pakan dapat diperoleh menggunakan rumus sebagai berikut (NRC 1993): EP = Efisiensi Pakan W t = Bobot ikan pada waktu akhir pemeliharaan (g) W 0 = Bobot ikan pada waktu awal pemeliharaan (g) W a = Bobot ikan yang mati selama pemeliharaan (g) F = Bobot pakan yang dikonsumsi selama penelitian (g) d. Retensi protein Retensi protein dapat diketahui dengan melakukan analisa proksimat protein tubuh ikan pada awal dan akhir pemeliharaan. Rumus retensi protein adalah sebagai berikut (Takeuchi 1988): Fp = Jumlah protein tubuh ikan pada waktu awal pemeliharaan (g) Lp = Jumlah protein tubuh pada waktu akhir pemeliharaan (g) P = Jumlah protein tubuh yang dikonsumsi selama pemeliharaan e. Retensi lemak Retensi lemak dapat diketahui dengan melakukan analisa proksimat lemak tubuh ikan pada awal dan akhir pemeliharaan. Rumus retensi lemak adalah sebagai berikut (Takeuchi 1988):
15 Fl = Jumlah lemak tubuh ikan pada waktu awal pemeliharaan (g) ll = Jumlah lemak tubuh pada waktu akhir pemeliharaan (g) L = Jumlah lemak tubuh yang dikonsumsi selama pemeliharaan f. Derajat Kelangsungan Hidup Derajat kelangsungan hidup (SR) dihitung berdasarkan Zonneveld et al. 1991: SR = kelangsungan hidup ikan (%) Nt = jumlah ikan uji pada awal percobaan (ekor) No = jumlah ikan uji pada akhir pemeliharaan (ekor) Analisa Kimia Analisa yang dilakukan dalam uji ini adalah analisa proximat bahan pakan (Tepung ikan, meat bone meal, Tepung Cangkang Udang, Tepung Cangkang udang yang dihidrolisis, Tepung Kedelai, Tepung Jagung, dan Tepung tapioka), pakan uji, dan ikan uji; Analisa kecernaan dengan mengukur kromium trioksida (Cr 2 O 3 ) serta analisa energi dengan menggunakan bom kalorimeter pada feses dan pakan kecernaan. Analisa proximat meliputi pengukuran kadar air, protein kasar, lemak kasar, kadar abu, serat kasar. Analisa proximat ini dilakukan dengan metode AOAC (1984) dalam Takeuchi (1988) (Lampiran 1). Parameter kualitas air diukur meliputi suhu, kadar oksigen terlarut, ph, nitrit dan amoniak. Hasil analisa kualitas air selama masa pemeliharaan masih dalam kisaran optimum untuk pemeliharaan ikan patin (Lampiran 9). Analisa Statistik Rancangan penelitian yang digunakan dalam uji pertumbuhan ikan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan empat perlakuan dan tiga ulangan. Data yang akan diperoleh kemudian ditabulasi dan dianalisa mengunakan program Excel MS Office 2007 dan untuk uji ANOVA dianalisis menggunakan program Minitab 16. Perlakuan yang berbeda akan diuji lanjut menggunakan uji Duncan