BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan mulai bulan Agustus 2008 sampai dengan Maret 2009. Tempat penelitian di Kebun IPB Tajur I dan analisis laboratorium dilakukan di Laboratorium Pusat Kajian Buah-Buahan Tropika (PKBT) IPB Baranang Siang Bogor dan Laboratorium RGCI Fakultas Pertanian IPB Dramaga Bogor. Pelaksanaan Penelitian 1 Penentuan sampel di lapang Dilakukan dengan cara menentukan 20 pohon manggis hasil grafting yang sedang berbunga, berumur seragam (7 tahun) dengan pertumbuhan yang relatif seragam. Pelabelan dilakukan terhadap tunas bakal bunga mulai dari terinisiasi tunas bakal bunga yang ditandai dengan terjadinya pembengkakan berwarna merah pada tunas-tunas pucuk hingga anthesis (mekar sempurna). Selanjutnya dilakukan pencatatan waktu terjadinya anthesis sebagai titik awal untuk menentukan umur buah yang akan dianalisis. Pengamatan morfologi bunga dilakukan terhadap 40 bunga dengan masing-masing 2 bunga per tanaman terhadap 20 pohon sampel. Pengamatan terhadap diameter buah dilakukan terhadap 20 buah yang waktu anthesisnya terjadi secara bersamaan, sedangkan untuk bobot basah dan bobot kering diperlukan 1 buah dengan 3 kali ulangan untuk setiap pengamatan sehingga sampai akhir penelitian dengan 6 kali pengamatan pada berbagai tingkat umur diperlukan 18 buah. Analisis padatan total terlarut, gula total, asam total tertitrasi, vitamin C, auksin, dan pigmen (klorofil dan antosianin) pada kulit buah diperlukan masing-masing 1 buah dengan 3 kali ulangan pada setiap pengamatan. Total buah yang diperlukan 128 buah. Buah-buah yang akan dianalisis setelah dipanen segera dibungkus dengan aluminium foil lalu dimasukkan ke cool box dan segera dilakukan analisis.
15 2 Pengamatan Meliputi pengamatan morfologi bunga, morfologi buah, dan fisiologi buah, yaitu : Morfologi Bunga : Dilakukan terhadap 40 bunga dari 20 pohon sampel terhadap tunas-tunas yang terinisiasi tunas bakal bunga hingga anthesis yang meliputi saat inisiasi tunas bakal bunga, pecah tunas bakal bunga, pembentukan kuncup, kuncup mulai membuka, dan anthesis. Morfologi Buah 1) Diameter Buah Pengukuran dilakukan pada umur 3-17 minggu setelah anthesis (MSA) dengan selang waktu 2 minggu terhadap buah-buah manggis yang telah ditentukan sebelumnya. 2) Bobot Segar Buah Analisis bobot segar buah dilakukan pada buah manggis umur 90 115 HSA dengan selang waktu 5 hari terhadap buah-buah yang telah ditentukan sebelumnya. 3) Bobot Kering Buah Pengukuran bobot kering buah manggis dilakukan pada umur 90 115 HSA dengan selang waktu 5 hari terhadap buah-buah yang telah ditentukan sebelumnya. Bobot kering buah dilakukan dengan cara mengoven buah (yang telah ditimbang bobot basahnya) pada suhu 70 80 C hingga mencapai berat yang konstan. Fisiologi Buah : Pengamatan terhadap perubahan-perubahan fisiologi buah manggis dilakukan pada umur 90 115 HSA dengan selang waktu 5 hari terhadap buah-buah yang telah ditentukan sebelumnya, yaitu terdiri dari :
16 1) Kadar Air Kadar air dihitung berdasarkan berat basah dan berat kering buah (Apriyantono et al. 1994) dengan menggunakan rumus: Berat basah Berat kering KA (%) = x 100% Berat Basah 2) Padatan Total Terlarut Penetapan padatan total terlarut (PTT) ditentukan dengan menggunakan hand refractometer, yaitu dengan cara daging buah manggis dihaluskan, kemudian beberapa tetes dari cairan tersebut diambil dan diteteskan pada permukaan prisma hand refractometer. Nilai PTT ditentukan dengan melihat angka yang tertera pada skala hand refractometer. 3) Gula Total Penetapan gula total dilakukan berdasarkan metode Anthrone (Apriyantono et al. 1994) dengan cara berikut : a) Pembuatan Kurva Standar Glukosa Larutan glukosa 0.2 mg/ml (10 mg glukosa + 50 ml aquadest) dipipet masing-masing sebanyak 0.1 ml, 0.2 ml, 0.3 ml, 0.4 ml, 0.5 ml, 0.6 ml,0.7 ml, 0.8 ml, 0.9 ml dan 1 ml ke dalam tabung reaksi. Pada masing-masing tabung reaksi ditambah aquades sampai volumenya menjadi 1 ml sehingga diperoleh larutan glukosa 0.02 mg/ml, 0.04 mg/ml, 0.06 mg/ml, 0.08 mg/ml, 0.10 mg/ml, 0.12 mg/ml, 0.14 mg/ml, 0.16 mg/ml, 0.18 mg/ml dan 0.2 mg/ml. Pereaksi anthron sebanyak 5 ml ditambahkan ke masing-masing tabung reaksi tersebut kemudian ditutup dengan kelereng dan diletakkan pada water bath suhu 100 ºC selama 12 menit kemudian didinginkan. Larutan pada masing-masing tabung dispektrofotometri pada panjang gelombang 630 nm. Dari hasil spektrofotometri dibuat kurva hubungan antara nilai absorban dengan konsentrasi glukosa (mg/ml) dan akan diperoleh suatu persamaan Y = bx + a.
17 b) Penyiapan Sampel Daging buah manggis sebanyak 10 gram digerus, kemudian ditambah 20 ml etil alkohol 80% (panas) dan dikocok selama 5 menit lalu disentrifugasi pada 4000 rpm selama 15 menit sehingga dihasilkan supernatan 1. Residu dari hasil sentrifugasi ditambah dengan 20 ml etil alkohol 80% (panas) dan dikocok selama 5 menit kemudian disentrifugasi pada 4000 rpm sehingga diperoleh supernatan 2. Supernatan 1 dan supernatan 2 digabungkan kemudian dipanaskan pada suhu 85 ºC hingga etanolnya menguap lalu ditera dengan aquadest sampai 100 ml. c) Penetapan Sampel Sampel (supernatan 1 dan 2) sebanyak 1 ml + 1 ml aquades + 5 ml pereaksi Anthrone dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditutup dengan kelereng. Tabung reaksi ditempatkan pada water bath suhu 100ºC selama 12 menit kemudian segera didinginkan dalam ice bath. Larutan dispektrofotometri pada panjang gelombang 630 nm. Kandungan gula total dalam sampel ditentukan berdasarkan kurva standar glukosa yang telah dibuat dengan menggunakan rumus berikut: x = (Y - a)/b x = [gula total] Y = nilai absorbansi sampel a = nilai yang diperoleh dari kurva larutan standar gula total b = nilai yang diperoleh dari kurva larutan standar gula total 4) Asam Total Tertitrasi Kadar asam total tertitrasi (ATT) pada buah manggis ditentukan dengan metode titrasi (Apriyantono et al. 1994) menggunakan laruan NaOH 0.1N. Daging buah manggis sebanyak 20 gram digerus, diambil 10 gram hasil gerusan tersebut (filtrat) kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Setelah itu ke dalam campuran ditambahkan aquades sampai tanda
18 tera, dikocok kemudian disaring. Filtrat sebanyak 20 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambah 1 2 tetes indikator fenolftalein 1% lalu dititrasi dengan NaOH 0.1 N hingga terbentuk warna merah muda stabil. Kadar ATT dihitung berdasarkan rumus berikut: ml NaOH x N NaOH x fp x 100 Kadar Asam Total Tertitrasi = (ml NaOH/100 g) gram contoh fp = faktor pengenceran = 5 5) Vitamin C Kadar vitamin C pada buah manggis ditentukan dengan metode titrasi (Sudarmadji et al. 1984) menggunakan Iodium 0.01N. Daging buah manggis sebanyak 20 gram digerus, diambil 10 gram hasil gerusan tersebut (filtrat) kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Setelah itu ke dalam campuran ditambahkan aquades sampai tanda tera, dikocok kemudian disaring. Filtrat sebanyak 20 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambah 1 2 tetes indikator amilum 1%, lalu dititrasi dengan iodium 0.01 N sampai timbul warna biru stabil. 1 ml iodium 0.01 N setara dengan 0.88 mg asam askorbat. Kadar vitamin C dihitung berdasarkan rumus berikut: ml Iod 0.01 N x 0.88 x fp x100 Vitamin C (mg/100g) = gram contoh fp = faktor pengenceran = 5 6) Auksin Analisis kandungn auksin (IAA) dilakukan dengan menggunakan kombinasi metode Unyanyar et al. (1996) untuk ekstraksi dan metode spektrofotometri dengan reagen Salkowsky untuk kuantifikasi (Pattern & Glick 2002) yaitu sebagai berikut:
19 a) Pembuatan Kurva Standar IAA Larutan IAA 50 ppm (2.5 mg IAA + 50 ml metanol) dipipet ke dalam tabung reaksi masing-masing 20 µl, 50 µl, 100 µl, 150 µl, 200 µl, 300 µl, 400 µl, 600 µl, 800 µl dan 1000 µl. Metanol ditambahkan ke dalam tabung reaksi sehingga volume masing-masing tabung reaksi menjadi 1000 µl (terdapat 1 ppm, 2.5 ppm, 5 ppm, 7.5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm dan 50 ppm IAA). Pada masingmasing tabung ditambahkan 4 ml larutan salkowsky dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu ruang lalu dispektrofotometri pada panjang gelombang 530 nm. Dari hasil spektrofotometri dibuat kurva larutan standar IAA dan akan diperoleh suatu persamaan Y = bx + a. b) Penetapan Sampel Kulit buah manggis sebanyak 1 gram digerus halus sambil dilarutkan dengan 60 ml pelarut (36 ml methanol + 15 ml chloroform + 9 ml NH 4 OH 2 N). Kemudian ditambah 25 ml aquades dan dituang ke dalam corong pisah sehingga terbentuk 2 fasa. Fasa bagian bawah (chloroform) dibuang. Sisa air dan methanol dievaporasi dan diekstraksi dengan etil asetat @ 15 ml sebanyak 3 kali, terbentuk 2 lapisan (lapisan bawah dibuang), kondisi ph dipertahankan 2.5 kemudian dilakukan penyaringan dengan menggunakan silika gel yang sudah digerus. Fraksi etil asetat yang sudah disaring lalu dievaporasi hingga kering dan dilarutkan dengan 1 ml metanol, ditambah 4 ml larutan Salkowsky dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu ruang, kemudian dispektrofotometri pada panjang gelombang 530 nm. Kandungan Auksin pada sampel dihitung berdasarkan kurva standar auksin menggunakan rumus berikut: x = (Y - a)/b x = [IAA] Y = nilai absorbansi sampel a = nilai yang diperoleh dari kurva larutan standar IAA b = nilai yang diperoleh dari kurva larutan standar IAA
20 7) Pigmen pada Kulit Buah Penentuan kadar klorofil dan antosianin yang terkandung pada kulit buah manggis dilakukan berdasarkan metode Sims dan Gamon (2002) sebagai berikut: Kulit buah manggis dihaluskan dengan blender. Filtrat sebanyak 0.5 gram dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi dan ditambahkan 5 ml Acetris, kemudian dikocok dan dicentrifuge pada 5000 rpm selama 10 menit. Supernatan diukur pada panjang gelombang 663 nm, 647 nm, 470 nm, dan 537 nm. Kadar klorofil dan antosianin yang terdapat pada kulit buah dihitung dengan menggunakan rumus : - Klorofil a = 0.01373 x A 663 0.000897 x A 537 0.003046 x A 647 - Klorofil b = 0.02405 x A 647 0.004305 x A 537 0.005507 x A 663 - Antosianin = 0.08173 x A 537 0.00697 x A 647 0.002228 x A 663 Dimana, A = nilai absorbansi pada panjang gelombang yang telah ditentukan. Analisis Data Data penelitian dianalisis dengan menggunakan uji DMRT (Duncan Multiple Range Test) pada taraf 5% dan untuk mengetahui korelasi antar peubah dilakukan analisis korelasi antar peubah (parameter) yang diamati dengan menggunakan program SPSS.