ISOLASI dan KARAKTERISASI α-amilase dari BAKTERI LAUT Vibrio sp. SFNB 3 TESIS Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister dari Institut Teknologi Bandung Oleh TUNJUNG MAHATMANTO NIM: 20506004 Program Studi Kimia INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2008
Surat Pernyataan Pelimpahan Hak Cipta dan Keaslian Hasil Karya Tulis Yang bertanda tangan di bawah ini: Nama : Tunjung Mahatmanto NIM : 20506004 menyatakan bahwa tesis dengan judul: Isolasi dan Karakterisasi α-amilase dari Bakteri Laut Vibrio sp. SFNB 3 dibawah bimbingan Dessy Natalia, Ph.D adalah hasil karya tulis yang didasarkan pada data hasil eksperimen dan perhitungan selama melakukan penelitian di Program Studi Kimia ITB. Bandung, 27 Juni 2008 Penulis, Tunjung Mahatmanto
ISOLASI dan KARAKTERISASI α-amilase dari BAKTERI LAUT Vibrio sp. SFNB 3 Oleh Tunjung Mahatmanto NIM: 20506004 Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung Menyetujui, Tanggal Pembimbing, Dessy Natalia, Ph.D
ABSTRAK ISOLASI DAN KARAKTERISASI α-amilase DARI BAKTERI LAUT Vibrio sp. SFNB 3 Oleh TUNJUNG MAHATMANTO NIM: 20506004 α-amilase (E.C 3.2.1.1) menghidrolisis secara acak ikatan α-1,4-o-glikosidik dari pati, glikogen, dan polisakarida lain untuk menghasilkan dekstrin, oligosakarida, maltosa dan glukosa. Enzim ini menyumbang sekitar 30% dari total produksi enzim dunia dan mempunyai aplikasi yang luas di dalam industri. Beberapa industri yang menggunakan α-amilase adalah industri pengolah pati, makanan, pemeraman, deterjen, tekstil, dan kertas. Tiap aplikasi industri mensyaratkan sifat yang khas dari α-amilase terkait dengan spesifisitas, stabilitas, dan pengaruh suhu serta ph terhadap aktivitasnya. Saat ini, hidrolisis enzimatis pati mentah sangat diperlukan untuk menekan konsumsi energi di dalam industri yang berbasis pati. Eksplorasi sumber-sumber baru penghasil α-amilase dan karakterisasi α-amilase yang dihasilkannya penting dilakukan untuk memfasilitasi penemuan α-amilase baru yang memenuhi persyaratan industri dengan kemampuan yang lebih baik, terutama dalam mendegradasi pati mentah. Salah satu sumber potensial penghasil α-amilase yang belum banyak dieksplorasi adalah bakteri laut. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi dan mempelajari karakteristik biokimiawi α-amilase dari bakteri laut Vibrio sp. SFNB 3. Pada suhu 30 o C dan penggoyangan 150 rpm, Vibrio sp. SFNB 3 memiliki fase pertumbuhan yang singkat dan pada jam ke-6 inkubasi fase stasioner telah dicapai. Sintesis α-amilase ekstraseluler oleh Vibrio sp. SFNB 3 berjalan mengikuti pertumbuhan selnya sehingga termasuk ke dalam tipe sintesis growth associated. Vibrio sp. SFNB 3 menghasilkan lebih dari satu jenis α-amilase dengan aktivitas spesifik terhadap pati terlarut 11 U/µg di bawah kondisi uji. Salah satu diantara α- amilase tersebut mempunyai kemampuan pengikatan pati mentah jagung. Isolasi α-amilase dari Vibrio sp. SFNB 3 dengan menggunakan pati mentah jagung memberikan yield sebesar 30% dengan tingkat kemurnian 2 kali lipat. Aktivitas spesifik α-amilase hasil isolasi terhadap pati terlarut adalah 21 U/µg di bawah kondisi uji. i
Penentuan massa molekul dengan menggunakan SDS PAGE menunjukkan bahwa α-amilase hasil isolasi mempunyai massa molekul sekitar 51 kda. Profil suhuaktivitas menunjukkan bahwa α-amilase hasil isolasi memiliki rentang suhu yang lebar untuk aktivitasnya. Pada rentang suhu 30-60 o C, α-amilase hasil isolasi memiliki aktivitas relatif diatas 88%. Suhu optimum untuk aktivitas α-amilase hasil isolasi adalah 50 o C. Nilai T 1 / 2 dari α-amilase hasil isolasi pada suhu ini adalah 194 menit. α-amilase hasil isolasi dapat bekerja pada rentang ph yang lebar. Pada rentang ph 5 hingga ph 8, α-amilase hasil isolasi memiliki aktivitas relatif diatas 85%. Profil ph-aktivitas dari α-amilase hasil isolasi menunjukkan aktivitas optimum dicapai pada ph 8. α-amilase hasil isolasi merupakan endo amilase dan mendegradasi pati terlarut dengan rentang produk yang lebar, dari glukosa hingga maltoheptaosa (G1 G7), setelah 48 jam inkubasi pada suhu 50 o C. α-amilase hasil isolasi memiliki kemampuan pendegradasian pati mentah jagung, menghasilkan maltosa hingga maltoheptaosa (G2 G7) setelah 72 jam inkubasi pada suhu 37 o C dan penggoyangan 150 rpm. Pemindaian mikroskop elektron (SEM) menunjukkan adanya pori-pori dan lubang-lubang besar pada permukaan granula pati mentah jagung akibat hidrolisis enzimatik oleh α-amilase hasil isolasi. Nilai Km, Vmax dan kcat α-amilase hasil isolasi adalah 10,7 mg/ml, 303 U/mL dan 5 x 10 4 s -1, berturut-turut. Berdasarkan karakteristik ini, α-amilase hasil isolasi dari bakteri laut Vibrio sp. SFNB 3 memiliki potensi yang besar untuk aplikasi industri, terutama industri yang berbasis pati. Kata kunci: α-amilase, bakteri laut, Vibrio sp., pati mentah jagung. ii
ABSTRACT ISOLATION and CHARACTERIZATION of α-amylase from MARINE Vibrio sp. SFNB 3 By TUNJUNG MAHATMANTO NIM: 20506004 α-amylases (EC3.2.1.1) randomly hydrolyze α-1,4-glucosidic bonds in starch, glycogen, and related polysaccharides to produce dextrins, oligosaccharides, maltose and glucose. These enzymes account for about 30% of the world s enzyme production and have a wide variety of industrial applications. Some of the industries that employ α-amylases are starch converting, food, brewing, detergent, textile, and paper industry. Each application requires unique properties with respect to specificity, stability, and temperature and ph dependence. In recent years, direct enzymatic hydrolysis of raw starch has become a vital necessity for reducing the energy consumption in starch based industries. Exploration of new sources of α-amylases and the characterization of the enzymes are essential in facilitating the discovery of novel α-amylases that meet the industrial requirements with better properties, especially in raw starch degradation. One of the potential sources of α-amylase yet to be further explored are the marine bacteria. The purpose of this research is to isolate and study the biochemical characteristics of a marine Vibrio sp. SFNB 3 α-amylase. At the temperature of 30 o C and shaking of 150 rpm, Vibrio sp. SFNB 3 has a short growth phase in which the stationary phase was reached on the 6 th hour of incubation. The extracellular α-amylase synthesis by Vibrio sp. SFNB 3 followed the bacterial cell growth and thus is a growth associated type of synthesis. Vibrio sp. SFNB 3 produced more than one kind of α-amylase with a specific activity of 11 U/µg towards soluble starch under the assay condition. One of the α-amylases has a raw maize starch binding ability. Isolation of the α-amylase from Vibrio sp. SFNB 3 using raw maize starch gave a 30% yield with a 2 fold purification degree. The specific activity of the isolated α-amylase is 21 U/µg towards soluble starch under the assay condition. iii
Molecular weight determination by SDS PAGE showed that the isolated α- amylase has a molecular weight of approximately 51 kda. The temperatureactivity profile showed that the isolated α-amylase has a wide range of temperature for its activity. At the temperature range of 30-60 o C, the isolated α- amylase has a relative activity above 88%. The optimum temperature for activity of the isolated α-amylase is 50 o C. The T 1 / 2 value of the isolated α-amylase at this temperature is 194 minutes. The isolated α-amylase worked at a wide range of ph. At the ph range of 5 to 8, the isolated α-amylase has a relative activity above 85%. The ph-activity profile of the isolated α-amylase exhibited an optimum activity at ph 8. The isolated α-amylase is an endo amylase and degrades soluble starch giving a wide range of products, from glucose to maltoheptaose (G1 G7), after 48 hours of incubation at the temperature of 50 o C. The isolated α-amylase has a raw maize starch degrading ability, giving maltose to maltoheptaose (G2 G7) after 48 hours of incubation at the temperature of 37 o C and shaking of 150 rpm. Scanning electron microscopy (SEM) displayed the presence of pores and large cavities on the surface of raw maize starch granules as a result of enzymatic hydrolysis by the isolated α-amylase. The Km, Vmax and kcat value of the isolated α-amylase is 10,7 mg/ml, 303 U/mL and 5 x 10 4 s -1, respectively. Based on these characteristics, the isolated α-amylase from the marine Vibrio sp. SFNB 3 is a potential candidate for industrial application, especially in starch based industries. Key word: α-amylase, marine bacteria, Vibrio sp., raw maize starch. iv
PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS Tesis S2 yang tidak dipublikasikan terdaftar dan tersedia di Perpustakaan Institut Teknologi Bandung, dan terbuka untuk umum dengan ketentuan bahwa hak cipta ada pada pengarang dengan mengikuti aturan HaKI yang berlaku di Institut Teknologi Bandung. Referensi kepustakaan diperkenankan dicatat, tetapi pengutipan atau peringkasan hanya dapat dilakukan seizin pengarang dan harus disertai dengan kebiasaan ilmiah untuk menyebutkan sumbernya. Memperbanyak atau menerbitkan sebagian atau seluruh tesis haruslah seizin Direktur Program Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung. v
UCAPAN TERIMA KASIH Alhamdulillahirrobbil alamin penulis ucapkan atas semua berkah, rahmat dan hidayah Allah SWT yang telah dilimpahkan kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan karya tulis ini. Terima kasih penulis ucapkan kepada: 1. Ibu Dessy Natalia, PhD sebagai dosen pembimbing yang dengan sabar telah memberi bimbingan, dukungan, serta dorongan semangat kepada penulis. 2. Kedua orang tua yang telah mendidik dan membesarkan penulis dengan penuh cinta dan kasih sayang. 3. Semua dosen dan karyawan di Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Bandung. 4. Keluarga dan teman-teman penulis atas doa, dukungan, dorongan, serta bantuan yang telah diberikan kepada penulis. 5. Sang kekasih yang tanpa henti mengalirkan kasih sayang dan cintanya kepada penulis. Karya tulis ini tentunya tidak terlepas dari kekurangan-kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan masukan dan kritikan yang membangun. Semoga karya tulis ini bermanfaat bagi kita semua. Bandung, Juli 2008 Penulis vi
DAFTAR ISI ABSTRAK... i ABSTRACT...iii PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS... v UCAPAN TERIMA KASIH... vi DAFTAR ISI... vii DAFTAR GAMBAR... ix DAFTAR TABEL... x DAFTAR LAMPIRAN... xi DAFTAR SINGKATAN... xii Bab I Pendahuluan... 1 Bab II Tinjauan Pustaka... 3 II.1 Pati... 3 II.2 Amilase... 5 II.2.1 Famili α-amilase... 5 II.2.2 Mekanisme Katalitik α-amilase... 7 II.2.3 Sumber α-amilase... 8 II.2.4 Karakteristik Biokimiawi α-amilase Mikrobial... 9 II.2.5 Aplikasi α-amilase... 10 II.3 Vibrio sp... 11 Bab III Metodologi Penelitian... 13 III.1 Alat... 13 III.2 Bahan... 13 III.3 Metodologi Penelitian... 14 III.3.1 Pembuatan Marine Broth... 14 III.3.2 Peremajaan Kultur Vibrio sp. SFNB 3... 14 III.3.3 Kurva Pertumbuhan dan Produksi α-amilase... 14 III.3.4 Isolasi α-amilase... 15 III.3.5 Uji Kualitatif Aktivitas α-amilase... 15 III.3.6 Uji Kuantitatif Aktivitas α-amilase... 16 vii
III.3.7 Penentuan Kadar Protein... 16 III.3.8 Penentuan Suhu Optimum α-amilase Hasil Isolasi... 16 III.3.9 Uji Stabilitas α-amilase Hasil Isolasi pada Suhu Optimum... 17 III.3.10 Penentuan ph Optimum α-amilase Hasil Isolasi... 17 III.3.11 Uji Hidrolisis Pati Mentah Jagung... 17 III.3.12 SEM (Scanning Electron Microscopy)... 18 III.3.13 Penentuan Mode Aksi α-amilase Hasil Isolasi... 18 III.3.14 Penentuan Km dan Vmax α-amilase Hasil Isolasi... 19 III.3.15 Native PAGE-Zymogram... 19 III.3.16 SDS PAGE-Silver Staining... 20 III.3.17 Penentuan Massa Molekul α-amilase Hasil Isolasi... 21 BAB IV Hasil dan Pembahasan... 22 IV.1 Kurva Pertumbuhan dan Aktivitas α-amilase Vibrio sp. SFNB 3... 22 IV.2 Produksi dan Isolasi α-amilase... 25 IV.3 Suhu Optimum α-amilase Hasil Isolasi... 27 IV.4 Kestabilan α-amilase Hasil Isolasi pada Suhu Optimum... 28 IV.5 ph Optimum α-amilase Hasil Isolasi... 29 IV.6 Hidrolisis Pati Mentah Jagung... 30 IV.7 Mode Aksi α-amilase Hasil Isolasi... 31 IV.8 Km, Vmax dan kcat α-amilase Hasil Isolasi... 33 BAB V Kesimpulan dan Saran... 35 V.1 Kesimpulan... 35 V.2 Saran... 35 DAFTAR PUSTAKA... 36 LAMPIRAN... 40 viii
DAFTAR GAMBAR Gambar II.1 Struktur amilosa (A) dan amilopektin (B)... 3 Gambar II.2 (β/α) 8 barrel dari enzim klan GH-H... 6 Gambar II.3 Skema α-retaining double displacement... 8 Gambar II.4 Vibrio nereis... 11 Gambar IV.1 Kurva pertumbuhan dan aktivitas α-amilase Vibrio sp. SFNB 3... 24 Gambar IV.2 Native PAGE-zymogram (A) dan SDS PAGE-silver staining (B) dari sampel dalam tiap langkah isolasi... 26 Gambar IV.3 Pengaruh suhu terhadap aktivitas α-amilase hasil isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3... 28 Gambar IV.4 Stabilitas α-amilase hasil isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3 pada 50 o C... 29 Gambar IV.5 Pengaruh ph terhadap aktivitas α-amilase hasil isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3... 29 Gambar IV.6 Profil hidrolisis pati mentah jagung 5% (w/v) oleh α-amilase hasil isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3... 31 Gambar IV.7 SEM permukaan pati mentah jagung... 32 Gambar IV.8 Kromatogram produk hidrolisis oleh α-amilase hasil isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3... 33 Gambar IV.9 Plot Lineweaver-Burk α-amilase hasil isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3... 34 Gambar L.1 Kurva standar glukosa... 40 Gambar L.2 Kurva standar BSA... 42 ix
DAFTAR TABEL Tabel II.1 Rasio antara amilosa dan amilopektin di dalam berbagai macam pati... 4 Tabel II.2 Empat daerah lestari pada β-sheet dalam urutan asam amino dari enzim-enzim famili α-amilase... 6 Tabel II.3 Enzim-enzim yang termasuk dalam klan GH-H famili α-amilase... 7 Tabel II.4 Penggunaan α-amilase di dalam berbagai industri... 10 Tabel IV.1 Ringkasan hasil isolasi α-amilase dari Vibrio sp. SFNB 3... 25 Tabel L.1 Absorban standar glukosa... 40 Tabel L.2 Absorban standar BSA... 42 Tabel L.3 Data OD sel kurva pertumbuhan Vibrio sp. SFNB 3... 43 Tabel L.4 Data uji DNS aktivitas α-amilase Vibrio sp. SFNB 3... 43 Tabel L.5 Data uji DNS α-amilase ekstrak kasar dan hasil isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3... 44 Tabel L.6 Data uji Bradford α-amilase ekstrak kasar dan hasil isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3... 44 Tabel L.7 Data uji DNS α-amilase hasil isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3 pada berbagai suhu... 45 Tabel L.8 Data uji DNS α-amilase hasil isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3 setelah inkubasi pada suhu optimum selama 0, 15, 30, 60, 120 dan 240 menit... 46 Tabel L.9 Data uji DNS α-amilase hasil isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3 pada berbagai ph... 47 Tabel L.10 Data uji hidrolisis pati mentah jagung 5% (w/v) oleh α-amilase hasil isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3 setelah inkubasi pada 37 o C, 150 rpm selama 24, 48 dan 72 jam dengan metode DNS... 48 Tabel L.11 Data uji DNS α-amilase hasil isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3 untuk penentuan waktu reaksi enzimatis... 49 Tabel L.12 Data uji DNS α-amilase hasil isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3 untuk penentuan Km dan Vmax... 49 x
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1 Kurva Standar Glukosa... 40 Lampiran 2 Langkah Perhitungan Aktivitas α-amilase... 41 Lampiran 3 Kurva Standar BSA... 42 Lampiran 4 Data OD Sel Kurva Pertumbuhan Vibrio sp. SFNB 3 dan Uji DNS Aktivitas α-amilase... 43 Lampiran 5 Data Uji DNS dan Uji Bradford α-amilase Ekstrak Kasar dan Hasil Isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3... 44 Lampiran 6 Data Uji DNS α-amilase Hasil Isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3 pada Berbagai Suhu... 45 Lampiran 7 Data Uji DNS α-amilase Hasil Isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3 setelah Inkubasi pada Suhu Optimum selama 0, 15, 30, 60, 120 dan 240 Menit... 46 Lampiran 8 Data Uji DNS α-amilase Hasil Isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3 pada Berbagai ph... 47 Lampiran 9 Data Uji DNS Hidrolisis Pati Mentah Jagung oleh α-amilase Hasil Isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3 setelah inkubasi pada 37 o C, 150 rpm selama 24, 48 dan 72 Jam... 48 Lampiran 11 Data Uji DNS α-amilase Hasil Isolasi dari Vibrio sp. SFNB 3 untuk Penentuan Nilai Km dan Vmax... 49 xi
DAFTAR SINGKATAN E.C GH TIM PDB DNS BSA SDS PAGE MB OD kda : Enzyme Commision : Glycoside Hydrolase : Triose Phosphate Isomerase : Protein Data Bank : Dinitrosalicylic acid : Bovine Serum Albumin : Sodium Dodecyl Sulfate : Polyacrylamide Gel Electrophoresis : Marine Broth : Optical Density : kilo Dalton xii