21 METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian Prioritas Nasional yang diketuai oleh Kustiyah (2009) dan dibiayai oleh DIKTI. Penelitian dilakukan di Laboratorium Pusat Penelitian Teh dan Kina (PPTK) Bandung untuk pembuatan teh hijau, teh hitam dan teh daun murbei serta menganalisis kandungan fitokimia teh hijau dan teh hitam. Analisis proksimat dilakukan di Laboratorium Departemen Gizi Masyarakat, Institut Pertanian Bogor (IPB). Pemeliharaan dan perlakuan pada hewan percobaan dilakukan di Laboratorium Pusat Penelitian dan Pengembangan Gizi, Departemen Kesehatan. Analisis kadar insulin darah dilakukan di Laboratorium Balai Penelitian Ternak (Balitnak) Ciawi Bogor dan analisis HbA1c dilakukan di Laboratorium Klinik Nugraha Bogor. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian meliputi bahan utama antara lain : teh hitam dan teh hijau klon Gambung 7 yang diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Teh dan Kina (PPTK) Bandung, daun murbei Morus kanva yang didapatkan dari Lembaga Masyarakat disekitar Hutan (LMDH) Sukamanah, Bandung, aloksan dari Sigma (A7413-10G) untuk membuat tikus normal menjadi diabetes, tikus jantan jenis Spraque Dawley yang diperoleh dari Puslitbang Gizi Depkes, ransum standar dan bahan kimia untuk analisis fitokimia serta proksimat. Peralatan yang digunakan adalah timbangan berat badan tikus, glukometer (Abbott Optium Omega Blood Glucose Monitoring System) untuk pengukuran kadar glukosa darah, spuit untuk menyuntikkan alloksan dan Sonde untuk mencekokan minuman, alat bedah (pinset, gunting, skapel), kandang metabolit, serta alat untuk analisis fitokimia dan proksimat. Metode Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap. Tahap pertama yaitu pembuatan teh hitam dan teh hijau (Lampiran 1), pengujian kandungan EGCG, theaflavin dan thearubigin (Lampiran 2), analisis proksimat (protein, abu, lemak, karbohidrat dan kadar air) dari teh hitam, teh hijau, teh daun murbei (Lampiran 3). Pada tahap ini
22 penelitian dilaksanakan di Laboratorium Pusat Penelitian Teh dan Kina (PPTK) Bandung dan Laboratorium Departemen Gizi Masyarakat. Tahap kedua dilakukan intervensi pada tikus percobaan normal dan tikus diabetes (yang diinduksi dengan aloksan) selama 16 hari pengamatan serta dilakukan analisa pada darah tikus meliputi uji toleransi glukosa, kadar glukosa, kadar hemoglobin glikosilat dan kadar insulin dari serum darah. Pengukuran lainnya juga dilakukan antara lain berat badan tikus selang dua hari, berat ransum, volume air minum dan volume urin tikus dilakukan setiap hari selama 16 hari pengamatan. Penyiapan Bahan Uji (Damayanthi et al. 2008) Sebanyak 20 gram teh hitam, 20 gram teh hijau, 20 gram teh daun murbei dan campuran teh hitam + teh daun murbei serta teh hijau + teh daun murbei (campuran 1:1), masing masing bahan diseduh dengan cara direndam menggunakan air panas (70 80 0 C) sebanyak 200 ml selama ±15 menit, kemudian disaring dan diambil filtratnya. Hewan Percobaan Sebanyak 42 ekor tikus jenis Sprague Dawley umur 2,5 3 bulan dengan berat badan 150 200 g digunakan dalam penelitian ini. Semua tikus dipelihara terlebih dahulu diadaptasi selama 5 hari untuk penyesuaian lingkungan. Tikus dikandangkan dengan pengaturan suhu (22 0 C) dan kelembaban (55%). Ruangan dikontrol dengan siklus 12 jam penerangan dan 12 jam gelap (Kim et al. 2006). Semua tikus dibagi menjadi 7 kelompok (Tabel 2). Perlakuan berlangsung selama 16 hari. Selama perlakuan berlangsung, berat badan tikus ditimbang setiap 2 hari sekali, pengukuran konsumsi ransum ditimbang setiap hari, volume air minum diukur setiap hari, pengukuran volume urin setiap hari (24 jam sekali). Pada hari ke 8 dan 16 pengamatan dilakukan pembedahan (pengambilan darah) untuk analisa kadar insulin dan kadar hemoglobin glikosilat (HbA1c). Skema alur percobaan dapat dilihat pada Gambar 6.
23 Tabel 2 Kelompok tikus percobaan berdasarkan jenis perlakuan Kelompok Kelompok 1 (Tikus normal) Kelompok 2 Kelompok 3 Kelompok 4 Kelompok 5 Kelompok 6 Kelompok 7 Perlakuan Kontrol normal diberi ransum standar + air kran ad libitum Kontrol negatif diberi ransum standar + air kran ad libitum Di cekok seduhan teh hitam (dosis 1 ml/hari/100 g BB) + ransum standar + air kran ad libitum Di cekok seduhan teh hijau (dosis 1 ml/hari/100 g BB) + ransum standar + air kran ad libitum Di cekok seduhan teh daun mubei (dosis 1 ml/hari/100 g BB) + ransum standar + air kran ad libitum Di cekok seduhan teh hitam+teh daun mubei (dosis 1 ml/hari/100 g BB) + ransum standar + air kran ad libitum Di cekok seduhan teh hijau+teh daun mubei (dosis 1 ml/hari/100 g BB) + ransum standar + air kran ad libitum Induksi Aloksan untuk membuat tikus diabetes (Andayani 2003; Ama 2009) Setelah melewati masa adaptasi, sebanyak 39 ekor tikus dibuat menjadi diabetes dengan diinduksi aloksan, induksi dilakukan dengan injeksi secara intraperitonial. Induksi dilakukan dengan menggunakan aloksan dalam larutan NaCl 0,9% dengan dosis 125 mg/kg BB. Tikus yang diinduksi tetap diberi makan dan minuman ad libitum. Dua hari setelah penyuntikan, kadar glukosa darah diukur dengan pengambilan darah awal dilakukan melalui ekor dari masing masing tikus. Tikus dengan kadar glukosa darah 200 mg/dl dikategorikan hiperglikemik dan siap digunakan dalam penelitian ini (Kim et al. 2006). Bila 5 hari setelah disuntik belum terjadi hiperglikemik maka dilakukan penyuntikkan kembali dan jika belum juga diabetes tikus tidak digunakan lagi.
42 ekor tikus Adaptasi 5 hari Induksi Aloksan dan dipelihara selama 2 hari Pengukuran kadar glukosa darah awal 3 ekor tikus normal 39 ekor tikus diabetes Kontrol normal Kontrol negatif Teh hitam Teh hijau Teh daun murbei Teh hitam + TDM Teh hijau + TDM 16 hari perlakuan Pengukuran Kadar Glukosa Darah, HbA1c dan Insulin pada hari ke 8 dan 16 Penimbangan BB tiap 2 hari Penimbangan sisa ransum setiap hari Pengukuran volume air minum Pengukuran volume urin setiap hari Gambar 6 Bagan Alur Percobaan
25 Pembuatan Ransum Standar Ransum tikus yang digunakan adalah ransum standar berdasarkan AOAC (1990) yang dimodifikasi oleh Laboratorium Biokimia dan Fisiologi Gizi Puslitbang Gizi dan Makanan Bogor. Ransum tikus yang digunakan adalah dalam bentuk bubuk. Komposisi ransum tikus dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3 Komposisi ransum standar tikus Bahan Tepung beras Tepung kedele Susu skim Minyak kelapa Mineral mix 1 dan Vitamin 2 Garam Jumlah (gram) 2500 1360 500 200 60 40 Keterangan : 1 Campuran mineral per kilogram ransum, terdiri dari : 139,3 gram NaCl, 0,79 gram KI, 389 gram KH 2 PO 4, 57,3 gram MgSO 4, 381,4 gram CaCO 3, 27 gram FeSO 4, 4,01 gram MnSO 4, 0,549 gram ZnSO 4, 0,477 gram CuSO 4, dan 0,023 gram CaCl 2. 2 Campuran vitamin per kilogram ransum, terdiri dari : 6000 IU vitamin A, 400 IU vitamin D, 10 mg vitamin E, 1 mg vitamin K, 5 mg folat, 30 mg tiamin HCl, 20 mg riboflavin, 5 mg piridoksin HCl, 20 mg Ca pantotenat, 100 mg nikotinamida, dan 150 g vitamin B 12 Prosedur Pengujian dan Rancangan Percobaan Uji Toleransi Glukosa Pengujian toleransi glukosa dilakukan menurut metode Varley & Gowenblock dalam Yulinah et al. (2001). Tiap kelompok uji terdiri dari tiga ekor tikus jantan dan secara keseluruhan terdiri dari enam kelompok. Sebelum percobaan tikus dipuasakan selama 18 jam, tetapi air minum tetap diberi. Setiap tikus diberi bahan uji sesuai dengan kelompoknya dan 1 jam kemudian diberi larutan glukosa 10% pada dosis 2,0 g/kg bb secara oral. Glukosa darah ditentukan sebelum pemberian glukosa dan pada 30, 60, 90,120 dan 150 menit setelah pemberian glukosa. Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) faktorial, yang terdiri atas dua perlakuan, masing-masing enam taraf. Jika perlakuan menunjukan berbeda nyata, maka untuk mengetahui perbedaan rerataan diantara perlakuan dilakukan dengan uji lanjut Duncan Multiple Range Test (DMRT). Perlakuan yang diberikan adalah :
26 A. Pemberian cekok (kontrol (tanpa cekok), teh hitam, teh hijau, teh daun murbei, campuran teh hitam + TDM dan campuran teh hijau + TDM). B. Waktu (menit ke-0, menit ke-30, menit ke-60, menit ke-90, menit ke-120 dan menit ke-150) n = 3 kali ulangan. Model linear yang digunakan adalah : = + i + j +( ij )+ ijk Keterangan: = nilai pengamatan pada pemberian cekok ke-i, waktu ke-j dan ulangan ke-k. m = nilai rata-rata. i = pengaruh pemberian cekok ke-i. = pengaruh waktu ke-j. j ij = pengaruh reaksi pemberian cekok ke-i dan reaksi waktu ke-j. ijk = galat error dari cekok ke-i, waktu ke-j dan ulangan ke-k. Metode Analisa Kadar Glukosa Darah Pengukuran kadar glukosa darah dengan glukometer menggunakan metode elektrokimia, yaitu berdasarkan pada pengukuran potensial (daya listrik) yang disebabkan oleh reaksi dari glukosa dengan bahan pereaksi glukosa pada elektroda strip. Stip uji mengandung bahan kimia, yaitu glucose oksidase 29,1% b/b, heksasianoferat (III) 32,0% b/b dan bahan bahan tidak reaktif yaitu 38,9 b/b. Prinsip kerjanya : sampel darah diserap masuk ke dalam ujung strip uji berdasarkan reaksi kapiler. Apabila darah mengisi ruang reaksi pada uji strip, kalium ferisianida diuraikan dan glukosa sampel dioksidasi oleh enzim glukosa oksidase yang menyebabkan penurunan bilangan oksidasi (kalium heksasianoferat (III) menjadi kalium heksasianoferat (II)). Aplikasi jumlah voltase yang konstan dari meteran mengoksidasi kalium heksasianoferat (II) kembali menjadi kalium heksasianoferat (III), dan memberikan elektron. Elektron yang dihasilkan untuk menimbulkan arus sebanding dengan kadar glukosa pada sampel. Setelah waktu 60 detik, konsentrasi glukosa pada sampel ditayangkan pada layar monitor.
27 Cara mengukur glukosa darah tikus percobaan : ekor tikus uji digunting selanjutnya darah yang menetes dikenakan pada strip glukometer. Kadar glukosa darah dinyatakan dalam mg/dl. Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) faktorial, yang terdiri atas dua perlakuan, masing-masing tujuh taraf dan dua taraf. Jika perlakuan menunjukan berbeda nyata, maka untuk mengetahui perbedaan rerataan diantara perlakuan dilakukan dengan uji lanjut Duncan Multiple Range Test (DMRT). Perlakuan yang diberikan adalah : A. Pemberian cekok (kontrol normal (tikus normal dan tanpa cekok), kontrol negatif (tikus diabetes) teh hitam (tikus diabetes), teh hijau (tikus diabetes), teh daun murbei (tikus diabetes), campuran teh hitam + TDM (tikus diabetes) dan campuran teh hijau + TDM (tikus diabetes)). B. Selisih (d1 (selisih kadar glukosa darah hari ke-0 dan ke-8, d2 (selisih kadar glukosa darah hari ke-0 dan ke-16) n = 3 kali ulangan. Model linear yang digunakan adalah : = + i + j +( ij )+ ijk Keterangan: = nilai pengamatan pada pemberian cekok ke-i, waktu ke-j dan ulangan ke-k. m = nilai rata-rata. i = pengaruh pemberian cekok ke-i. = pengaruh waktu ke-j. j ij = pengaruh reaksi pemberian cekok ke-i dan reaksi waktu ke-j. ijk = galat error dari cekok ke-i, waktu ke-j dan ulangan ke-k. Kadar Hemoglobin Glikosilat (HbA1c) HbA1c diukur dengan menggunakan Nycocard Reader II HbA1c Test (Axis-Shield USA). Cara pengukuran HbA1c dapat dilihat pada Gambar 6. Pertama masukkan sebanyak 5 µl sampel dalam cairan pelarut dan kocok dengan baik. Kemudian masukkan 50 µl sampel yang telah diencerkan ke Test Device biarkan meresap sempurna selama ±20 detik. Tambahkan 25 µl R2/washing
28 solution. Biarkan meresap sempurna selama ±10 detik. Baca hasil dengan menggunakan Nycocard Reader II dalam waktu kurang 5 menit. Gambar 7 Prosedur Kerja Pengujian HbA1c Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) faktorial, yang terdiri atas dua perlakuan, masing-masing tujuh taraf dan dua taraf. Jika perlakuan menunjukan berbeda nyata, maka untuk mengetahui perbedaan rerataan diantara perlakuan dilakukan dengan uji lanjut Duncan Multiple Range Test (DMRT). Perlakuan yang diberikan adalah : A. Pemberian cekok (kontrol normal (tikus normal dan tanpa cekok), kontrol negatif (tikus diabetes) teh hitam (tikus diabetes), teh hijau (tikus diabetes), teh daun murbei (tikus diabetes), campuran teh hitam + TDM (tikus diabetes) dan campuran teh hijau + TDM (tikus diabetes)). B. Waktu pengamatan (8 dan 16 hari) n = 3 kali ulangan. Model linear yang digunakan adalah : = + i + j +( ij )+ ijk Keterangan: = nilai pengamatan pada pemberian cekok ke-i, waktu ke-j dan ulangan ke-k. m = nilai rata-rata. i = pengaruh pemberian cekok ke-i. j = pengaruh waktu ke-j. ij = pengaruh reaksi pemberian cekok ke-i dan reaksi waktu ke-j. ijk = galat error dari cekok ke-i, waktu ke-j dan ulangan ke-k.
29 Kadar Insulin Darah Pengukuran kadar insulin pada darah tikus ditentukan secara Radioimmunoassay (RIA) dengan menggunakan prosedur sesuai peunjuk kit RIA insulin Coat-A-Count dari Diagnostic Products Coorporation. Cara kerjanya : pipet 200 µl serum darah pada kalibrator nol A dalam NSB (nonspesifific binding) dan tabung A, dan 200 µl dari setiap kalibrator yang tersisa, kontrol dan sampel darah ke dalam tabung yang telah disediakan. Tambahkan 1.0 ml buffer insulin ke setiap tabung. Vorteks sebentar dan hati hati (sampel jangan sampai tumpah dari tabung). Inkubasi selama 3 jam pada suhu 37 0 C. Sampel dituangkan (pindahkan semua cairan dengan hati hati. Gunakan rak busa penuangan, tuangkan kandungan dari semua tabung (kecuali tabung T) dan biarkan semua mengalir selama 2 3 menit. Kemudian pukulkan tabung pada kertas absorbent untuk mengeluarkan semua sisa tetesan. Hitung selama 1 menit pada gamma counter. Net Counts = rata rata CPM rata rata NSB CPM. Kemudian untuk menentukan ikatan dari masing masing tabung sebagai persen dari maximum binding (MB), dengan NSB-angka yang telah dikoreksi dari tabung A diambil sebagai 100% : Persen ikatan = Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) faktorial, yang terdiri atas dua perlakuan, masing-masing tujuh taraf dan dua taraf. Jika perlakuan menunjukan berbeda nyata, maka untuk mengetahui perbedaan rerataan diantara perlakuan dilakukan dengan uji lanjut Duncan Multiple Range Test (DMRT). Perlakuan yang diberikan adalah : A. Pemberian cekok (kontrol normal (tikus normal dan tanpa cekok), kontrol negatif (tikus diabetes) teh hitam (tikus diabetes), teh hijau (tikus diabetes), teh daun murbei (tikus diabetes), campuran teh hitam + TDM (tikus diabetes) dan campuran teh hijau + TDM (tikus diabetes)). B. Waktu pengamatan (8 dan 16 hari)
30 n = 3 kali ulangan. Model linear yang digunakan adalah : = + i + j +( ij )+ ijk Keterangan: = nilai pengamatan pada pemberian cekok ke-i, waktu ke-j dan ulangan ke-k. m = nilai rata-rata. i = pengaruh pemberian cekok ke-i. = pengaruh waktu ke-j. j Pengukuran Jumlah Ransum Pemberian ransum dilakukan setiap hari secara ad libitum, ransum dan sisa ransum ditimbang setiap hari pada waktu yang sama dan dinyatakan dalam satuan gram untuk mengetahui keadaan diabetes berpengaruh pada total konsumsi ransum tikus selama percobaan. Jumlah konsumsi ransum dihitung dengan mengurangi jumlah ransum yang diberikan dengan sisa ransum yang telah ditimbang. Pengukuran Volume Minum Pemberian air minum dilakukan setiap hari secara ad libitum, air minum dan sisa air minum dihitung volume setiap hari pada waktu yang sama dan dinyatakan dalam satuan ml untuk mengetahui keadaan diabetes berpengaruh pada total konsumsi air minum tikus selama percobaan. Jumlah volume air minum dihitung dengan mengurangi volume air minum yang diberikan dengan sisa air minum yang telah diukur volumenya. Pengukuran Berat Badan Tikus Berat badan tikus selama pengamatan ditimbang setiap 2 hari sekali dengan tujuan untuk memonitor tingkat pertambahan atau penurunan berat badan tikus. Pengukuran berat badan tikus dilakukan dengan menggunakan timbangan pegas dalam satuan gram.
31 Pengukuran Volume Urin Pengukuran volume urin untuk melihat perubahan volume urin yang dihasilkan. Urin ditampung dalam gelas ukur dan dikumpulkan selama 24 jam kemudian dilihat volume urin yang dihasilkan selama 24 jam. Analisis Data Hasil yang diperoleh dari penelitian ini dianalisis dengan menggunakan Analysis of variance (ANOVA), yang dilakukan untuk menganalisis data yang diperoleh dari masing-masing kelompok perlakuan dengan menggunakan program SPSS dan Microsof excell. Tingkat signifikansi dinyatakan dalam = 5 %.