BAB V. TEORI KROMATOGRAFI PLANAR A. PENDAHULUAN Meliputi: kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis. Kromatografi kertas mulai dikenal sejak tahun 1800-an. Di Belanda, sejak tahun 1905 kromatografi kertas (KK) mulai digunakan untuk mengevaluasi beberapa tanaman obat dan mulai tahun 1920 digunakan untuk pemeriksaan rutin di German. Pada tahun 1930 mulai digunakan senyawa alumina yang dilapiskan pada plat gelas untuk pemeriksaan tingtura. Mulai tahun 1940 KKt digunakan untuk pemeriksaan rutin asam amino, antibiotik, nukleotida dan senyawa radioaktif, Saat ini hampir 40% metode yang tertera dalam USP menggunakan kromatografi planar, sedangkan hampir 80 % lebih metode kromatografi planar dipergunakan di Jepang dan Cina. Kromatografi planar adalah kromatografi dengan fase diam yang dilapiskan pada penyangga. Kromatografi ini merupakan metode pemisahan berdasarkan sifat fisikokimia. Pemisahan terj'adi karena adanya perbedaan distribusi tiap komponen dalam dua fase yaitu fase diam dengan luas area yang besar dan fase gerak yang bergerak melalui fase diam baik bergerak karena gaya kapiler atau dengan tekanan yang membantu mengalirkan fase gerak. Fase diam dan fase gerak ditempatkan dalam tabung atau bejana tertutup. Pergerakan analit atau solut diekspresikan dengan faktor retardasi (R F ) yang merupakan perbandingan antara jarak rambat solut dari tempat penotolan sampel dibandingkan dengan jarak rambat fase gerak dari tempat penotolan, atau dengan persamaan V.1 berikut ini. R F =. V.1 hr F = R x 100 V.2 Pada awalnya kromatografi planar hanya mencakup kromatografi kertas tetapi kemudian dikembangkan dan ditemukan kromatografi lapis tipis (KIT). Hingga saat ini KIT banyak digunakan dalam berbagi analisis baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif di bidang kimia organik maupun inorganik dan biologik. KIT juga banyak digunakan dalam bidang kimia klinik untuk menunjang
diagnosis dokter. Pemakaian KIT semakin meluas sejak dikembangkan sistem instrumentasi yang memudahkan pelaksanaan dan memberikan tampilan dan hasil pemisahan yang lebih memuaskan, seperti instrumentasi untuk penotolan, untuk pengembangan, scanning bercak dan berbagai reagen untuk mendeteksi. Beberapa keuntungan dari pemakaian KIT adalah lebih sederhana, pengerjaannya cepat, serba guna, dapat diaplikasikan untuk banyak sampel, reagen dan instrumentasi lebih- murah daripada jenis kromatografi yang lain. B. TEKNIK PELAKSANAAN Sebelum dianalisis dengan KIT, setiap sampel pastilah melalui berbagai tahapan. Berikut ini adalah tahapan-tahapan yang harus dilakukan bila hendak menganalisis sampel menggunakan KIT 1. Pengambilan dan penyimpanan sampel Jika tidak langsung dianalisis, sampel harus segera disimpan dalam suhu 2-4 C atau -20 s/d -70 C bila selang waktu untuk dia nalisis cukup panjang (skala bulan). Jika perlu ditambah asam, alkali atau pelarut penstabil yang lain untuk menghindari degradasi senyawa yang mau dianalisis. Selama penyimpanan harus menggunakan wadah yang inert. 2. Preparasi sampel Biasanya meliputi : Melarutkan dengan pelarut yang sesuai Memisahkan matrik yang ikut terlarutkan bisa dengan sentrifugasi untuk memisahkan partikel terdispersi, presipitasi dan deproteinasi, ultraflltrasi, dialisis terutama untuk memisahkan makromolekul, hidrolisis terutama untuk sampel dalam bentuk terkonjugasi, ekstraksi bisa ekstraksi cair-cair atau ekstraksi padat cair Pemekatan dan pemurnian untuk mendapatkan ekstrak sampel yang pekat dan lebih murni 3. Pengaplikasian sampel ke dalam KLT Tahapan penotolan sampel merupakan tahapan kritis yang mempengaruhi hasil pemisahan dan ketepatan analisis. Ukuran dan bentuk totolan merupakan faktor yang menentukan pada hasil resolusi pemisahan. Pemisahan akan optimal bila ukuran dan lebar penotolan dibuat sekecil mungkin. Overload baik sampel maupun pelarut dapat menurunkan derajat
pemisahan. Penotolan secara manual seringkali menyebabkan difusi dan double packing. Berikut ini variasi jumlah sampel yang direkomendasikan untuk KLT dan disesuaikan berdasarkan tujuan analisis : Tujuan Diameter spot (mm) Konsentrasi Densitometri 2 mm untuk 0.5 µl volume sampel Identifikasi 3 mm untuk 1 µl Test kemurnian volume sampel 4 mm untuk 2 µl volume sampel sampel (%) Jumlah sampel (µg) 0.02-0.2 0.5-1 (HPTLC) 0.1-1 1-20 5 100 1-10 (konvensional) Volume terkecil yang dapat diaplikasikan secara manual untuk memperoleh reprodusibilitas yang baik adalah 0.5 µj. Bila volume sampel lebih dari 2-10µl, maka penotolan disarankan secara bertahap dengan menunggu totolan kering sebelum penotolan berikutnya. Preadsorbent KLT juga dapat digunakan untuk membuat totolan yang sekecil mungkin. Preadsorbent plate adalah plat yang dilapisi dengan dua jenis material yang berbeda. Di bagian bawah plate dilapisi dengan bahan penyerap yang inert sehingga tidak terjadi pemisahan, di tempat ini sampel diaplikasikan. Dengan memasukkan plate ke dalam solvent fase gerak maka sampel akan mengembang dan bergerak ke atas. Ketika sampel sampai batas permukaan antara dua lapisan penyerap, sampel akan di-compact sehingga memperbaiki pemisahan. 4. Penjenuhan bejana kromatografi Dikerjakan dengan memasukan fase gerak ke dalam bejana hingga ketinggian 0.5-1.0 cm. Masukkan kertas saring dan diposisikan berdiri tegak. Diamkan selama lebih kurang satu jam atau sampai kertas saring terbasahi semua oleh fase gerak. Penjenuhan bejana harus dilakukan terlebih dahulu untuk memperoleh pemisahan yang cepat, reprodusibilitas dan konsistensi harga RF yang tinggi.
5. Pengembangan plate KIT Setelah penotolan selesai dilakukan dan bejana telah jenuh, maka plate KIT dimasukkan ke dalam bejana. Biarkan sampai fase gerak mencapai batas akhir elusi yang dikehendaki. Kemudian plate diambil dan dikeringkan pada suhu kamar atau dalam oven listrik sesuai suhu yang diharapkan. Selanjutnya dikerjakan pemeriksaan hasil elusi dengan detektor yang sesuai. Sekarang telah dikembangkan beragam teknik pengembangan plat disertai instrumentasi yang dibutuhkan. Teknik-teknik pengembangan plate KLT antara lain : a. Konvensional dan KLTKT Secara konvensional plate dikembangkan secara vertikal ke atas. Ujung bawah plate dicelupkan ke dalam bejana sedemikian rupa totolan sampel jangan sampai tercelup. bejana dipastikan harus jenuh dengan uap solvent fase gerak sebelum dipakai. Jarak pngembangan sekitar 10-15 cm untuk plate normal (20 (am) dan untuk KLTKT dengan ukuran partikel sorbent 5 urn adalah 3-6 cm. b. Pengembangan dua dimensi Sampel ditotolkan di atas plate kemudian dikembangkan sepert no. 1, kemudian dikeringkan. Plate dikembangkan lagi dengan arah digeser 90 dari pengembangan yang pertama. Fase gerak untuk pengembangan kedua dapat sama atau berbeda dengan yang pertama, sesuai dengan kebutuhan. Melalui teknik ini, pemisahan dapat disempurnakan hingga mampu memisahkan 150-300 komponen serta meningkatkan kapasitas spot. 6. Analisis kualitatif dan kuantitatif Kualitatif :Membandingkan harga RF dengan standar Kuantitatif :Membandingkan ukuran dan intensitas spot sampel dengan standar, baik secara langsung atau tak langsung. Secara langung dengan densitometer, hyphenated TLC/MS atau TLC/FTIR. Secara tidak lansung dengan ekstraksi spot dilanjutkan spektrofotometri. Bila sampel tidak berwarna atau tidak berfluoresensi maka dapat direaksikan dengan pereaksi tertentu agar dapat dibaca dengan spektrofotometer atau spektrofluorometer. Teknik demikian disebut derivatisasi pasca kromatografi.
Metode penampakan bercak: a. Dilihat secara visual untuk senyawa-senyawa yang berwarna. b. Dilihat pada sinar UV 254 nm, untuk senyawa-senyawa yang dikembangkan di atas plate yang diimpregnasi dengan phosphor c. Dilihat pada sinar UV 350 nm, untuk senyawa yang berfluoresensi secara alami. d. Senyawa-senyawa obat kadang-kadang tidak menyerap sinar UV bila ofeat-obat ini berada dalam bentuk ion, seperti barbiturat tidak akan berwama bfe fase geraknya asam tapi akan menjadi berwarna bila ditiupkan gas arnonaii atas bercak. Ditambahkan pereaksi pembentuk warna, misalnya : i. Uap iodine dapat mensubstitusi ikatan karbon tidak jenuh dalam sampel ii. Larutan asam sulfat metanolik dilanjutkan pemanasan 90 C selama 30 menit dapat mengarangkan sampel organik dan memberikan bereat hitam iii. Larutan ninhidrin digunakan untuk menampakkan spot amine primer dan sekunder iv. Larutan iodoplatinate dapat menampakkan spot amine primer, sekunder, tertier maupun ammonium kuarterner. C. PENGEMBANGAN METODE 1. Fase diam atau sorbent Dalam Kromatografi kertas (KKt) sebagai sorbent-nya adalah a-selulosa yang memiliki sifat sebagai ion-exchange yang lemah dan bersifat polar. Untuk keperluan pemisahan senyawa yang lipofi, sorbent ini dapat dimodifikasi dengan esterifikasi atau silicone treatment. Untuk pemisahan radiopharmaceuticals dapat dipakai sorbent lapisan glass microfiber yang diimpregnasi dengan silica gel atau silicic acid yang banyak dijual diperdagangan dan disebut sebagai Instant Thin layer Chromatography(lTC) Dalam KIT, Silika gel dipakai secara luas sebagai sorbent yang diikatkan pada plate gelas. Untuk meningkatkan gaya adhesi antara silica dengan gelas, sering ditambahkan binding agents seperti Calsium Sulphat. Biasanya pengembangan dilakukan dengan solvent anhidrat sehingga perlu
mengatur kadar air atau kelembabannya. Idealnya plate silica ini dipakai pada kadar air 11-12 %. Sorbent silika ini dapat dimoifikasi untuk membentuk plate yang bersifat apolar dengan jalan : 1. Diimpregnasi dengan paraffin liquid, minyak silikon atau lemak, rantai alkil seperti C 18, Q, C 2, dan sebagainya. Reverse Phase Chromatography ini dapat digunakan untuk identifikasi hormon steroid. 2. Mengikatkan secara kimiawi rantai hidrokarbon (seperti monoklorosilane) pada silika gel. Plate ini lebih reprodusible daripada cara satu. Reversed Phase silica gel yang diimpregnasi dengan chiral selector (derivat proline) dan ion Cu 2+ merupakan sorbent paling populer untuk mengontrol kemurnian optik suatu senyawa misalnya pada campuran D,L Dopa dan D,L Penicillamine. Sorbent Alumina dapat digunakan untuk pemisahan vitamin larut lemak, alkaloid dan beberapa antibiotik. Sorbent selulosa digunakan untuk pemisahan sulfonamida, asam nukleat dan steroid sulfat. Sistem pemisahan dalam sorbent selulosa ini didasarkan pada pertukaran ion. 2. Perbandingan QTLC dengan HPLC Bila dibandingkan dengan HPLC, teknik QTLC (Quantitative thin layer chromatography) memiliki banyak kelebihan : Preparasi sampel sampel lebih sederhana karena fase diam KLT biasanya disposable (hanya dipakai untuk satu kali pakai) berbeda dengan HPLC yang dapat dipakai untuk berulang-ulang. Oleh karena itu dengan KLT tidak dikawatirkan adanya kontaminan dalam sampel yang mengkontaminasi fase diam. Sebaliknya dengan HPLC maka adanya kontaminan dalam sampel harus dihindarkan, sedapat mungkin sampel murni sehingga tidak banyak sampah yang dapat mengotori fase diam. Volume sampel yang diaplikasikan dapat lebih banyak daripada HPLC. Aplikasi sampel dapat dilakukan teknik spraying. Pengaruh fase gerak dapat dihilangkan dengan mudah yaitu dengan menguapkan plat hasil kromatografi terlebih dahulu sebelum dilihat dengan detektor. Jumlah fase gerak jauh lebih sedikit daripada HPLC.
Semua senyawa dalam sampel tertahan dalam plat sehingga memungkinkan deteksi sampel dekerjakan lebih dari satu kali untuk memperoleh informasi yang lebih kompleks. Kromatografi dua dimensi tidak mungkin dikerjakan dengan HPLC. Berbagai kombinasi fase gerak dan fase diam tidak dapat dilakukan dengan mudah dalam HPLC karena faktor biaya analisis. Biaya analisis lebih murah baik untuk biaya pengadaan fase diam maupun fase gerak.