MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian dilakukan selama 4 bulan di Laboratorium Teknologi Hasil Ternak dan Laboratorium Terpadu Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dimulai pada bulan Februari sampai dengan Mei 2012. Materi Bahan yang digunakan untuk memproduksi bakteriosin adalah Lactobacillus plantarum 2C12 (asal daging sapi, koleksi Laboratorium Terpadu, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan IPB), media De Man Rogosa and Sharpe broth (MRSB), yeast extract (YE) 3%, NaCl 1%, NaOH 0,1 N, ammonium sulfat, buffer kalium fosfat, membran diálisis dan aquadest. Bahanbahan yang diperlukan untuk pembuatan sosis adalah daging bagian kelapa (knuckle) sapi dari RPH Eldiers setelah 4 jam postmortem, tepung tapioka, STPP, garam, es batu, bawang putih, nitrit, susu skim, gula, minyak goreng, dan merica. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini pipet volumetrik, tabung reaksi, rak tabung reaksi, ose, cawan petri, membran saring Sartorius, gelas ukur, mikro pipet, sentrifuse, incubator, refrigerator, membran dialisis, plastic wrap, alumunium foil, kapas, oven, autoclave, vortex, ph meter, botol Schott dan bunsen. Alat-alat untuk pembuatan sosis yaitu pisau, talenan, food processor, dan stuffer. Prosedur Tahap 1. Purifikasi Bakteri (Todorov et al., 2008 dan Abo-Amer, 2007) Sebanyak 1 liter media MRS broth (MRSB) ditambah yeast ekstrak 3% dan NaCl 1% diinokulasi dengan 10% (v/v) kultur Lactobacillus plantarum 2C12, dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 20 jam kemudian disimpan pada refrigerator suhu 4 o C selama 2 jam. Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 5.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 o C, dan dilakukan penyaringan dengan menggunakan membran saring Sartorius, selanjutnya ph supernatan bebas sel dinetralkan sehingga menjadi ph 6 dengan menggunakan 0,1 N NaOH. 15
a. Purifikasi Parsial dengan menggunakan Presipitasi Amonium Sulfat Penyaringan dengan menggunakan membran saring Sartorius berdiameter 0,22 µm dan selanjutnya supernatan bebas sel (SBS) dinetralkan menjadi ph 6 menggunakan 0,1 N NaOH. Semua tahapan proses ini dilakukan pada suhu dingin. Proses perbanyakan dan penyegaran kultur dapat dilihat pada Gambar 1. 1,56 g MRSB + 0,9 g YE+ 10 ml aquadest 5,2 g MRSB+ 3 g YE+ 100 ml aquadest 23,4 g MRSB+ 13,5 g YE + 450 ml aquadest (duplo) Dipanaskan, distirer Didinginkan pada suhu ruang Dipanaskan, distirer Didinginkan pada suhu ruang Dipanaskan, distirer Didinginkan pada suhu ruang Dipipet ke masingmasing tabung reaksi sebanyak 4,5 ml Di autoclave 121 0 C 15 menit Diinokulasi dengan bakteri L.plantarum 2C12 sebanyak 0,5 ml Diinkubasi 24 jam Dipipet ke masingmasing erlenmeyer sebanyak 45 ml Di autoclave 121 C 15 menit Diinokulasi dengan bakteri sebanyak 5 ml Diinkubasi 24 jam Wadah yang berisi larutan ditutup dan di autoclave 121 0 C 15 menit Diinokulasi dengan bakteri sebanyak 50 ml Diinkubasi 24 jam Gambar 1. Proses Perbanyakan dan Penyegaran Kultur 16
Tabel 2. Penggunaan Padatan Amonium Sulfat (% Penjenuhan) Awal 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Konsentrasi Akhir dari Padatan Amonium Sulfat (g per 1000 ml) 0 10,6 13,4 16,4 19,4 22,6 25,8 29,1 32,6 36,1 39,8 43,6 47,6 51,6 55,9 60,3 65 69,7 5 7, 9 10,8 13,7 16,6 19,7 22,9 26,2 29,6 33,1 36,8 40,5 44,4 48,4 52,6 57 61,5 66,2 10 5,3 8,1 10,9 13,9 16,9 20 23,3 26,6 30,1 33,7 37,4 41,2 45,2 49,3 53,6 58,1 62,7 15 2,6 5,4 8,2 11,2 14,1 17,2 20,4 23,7 27,1 30,6 34,3 38,1 42 46 50,3 54,7 59,2 20 0 2,7 5,5 8,3 11,3 14,3 17,5 20,7 24,1 27,6 31,2 34,9 38,7 42,7 46,9 51,2 55,7 25 0 2,7 5,6 8,4 11,5 14,6 17,9 21,1 24,5 28 31,7 35,5 39,5 43,6 47,8 52,2 30 0 2,8 5,6 8,6 11,7 14,8 18,1 21,4 24,9 28,5 32,3 36,2 40,2 44,5 48,8 35 0 2,9 5,7 8,7 11,8 15,1 18,4 21,8 25,8 29,6 32,9 36,9 41 45,3 40 0 2,9 5,8 8,9 12 15,3 18,7 22,2 26,3 29,6 33,5 37,6 41,8 45 0 3 5,9 9 12,3 15,6 19 22,6 26,3 30,2 34,2 38,3 50 0 3 6 9,2 12,5 15,9 19,4 23,5 26,8 30,8 34,8 55 0 3,1 6,1 9,3 12,7 16,1 20,1 23,5 27,3 31,2 60 0 3,1 6,2 9,5 12,9 16,8 20,1 23,9 27,9 65 0 3,2 6,3 9,7 13,2 16,8 20,5 24,4 70 0 3,2 6,5 9,9 13,4 17,1 20,9 75 0 3,3 6,6 10,1 13,7 17,4 80 0 3,4 6,7 10,3 13,9 85 0 3,4 6,8 10,5 90 0 3,4 7 95 0 3,5 100 0 17
Serbuk ammonium sulfat ditambahkan sebanyak empat kali secara bertahap (20%, 40%, 60%, dan 80%) ke dalam supernatan antimikroba yang telah disaring steril untuk menghasilkan endapan protein, kemudian dihomogenkan secara perlahan pada suhu 4 C selama dua jam. Kebutuhan padatan ammonium sulfat dapat dilihat pada Tabel 2. Selanjutnya, supernatan dibuang dan didapatkan presipitat bakteriosin. Presipitat dikoleksi pada satu tabung Falcon. b. Dialisis Dialisis dilakukan dengan tujuan untuk menghilangkan garam amonium sulfat yang masih bercampur dengan presipitat bakteriosin. Proses dialisis menggunakan Buffer pottasium phospat. Buffer pottasium phospat yaitu campuran KH 2 PO 4 dan K 2 HPO 4. Proses pembuatan buffer yaitu dengan 49,7 ml K 2 HPO 4 dan 50,3 ml KH 2 PO 4 dalam larutan 100 ml kemudian diukur ph hingga mencapai ph 6. Dialisis dilakukan dengan menggunakan membran dialisis diameter 20 pada Buffer potassium phospat. Buffer diganti saat jam ke-2 dan jam ke-4, kemudian dibiarkan hingga 16 jam. Proses dilakukan di dalam refrigerator dengan menggunakan stirrer. Setelah selesai, didapatkan ekstrak kasar bakteriosin. Pengecekan protein plantaricin hasil dialisis diamati dengan menggunakan Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 280 nm. Tahap 2. Pembuatan Sosis Daging Sapi dengan Penambahan Bakteriosin sebagai Pengawet Alami Daging, garam, STTP, bahan pengawet dan sepertiga bagian es digiling dalam food processor. Kedua, susu skim, bawang putih, merica, pala, jahe, ketumbar, lemak, minyak, dan sepertiga bagian es. Terakhir ditambahkan tepung tapioka dan sepertiga bagian es sisanya. Bahan pengawet ditambahkan berdasarkan tiga perlakuan yaitu tanpa bahan pengawet alami (kontrol); nitrit 0,3%; dan bakteriosin 0,3%. Adonan digiling ke dalam food processor hingga bercampur semua. Adonan dimasukkan ke stuffer agar dapat dipindahkan ke dalam selongsong sosis (casing). Sosis mentah kemudian direbus di dalam panci selama 45 menit dengan suhu 60-70 o C. Sosis yang telah matang kemudian disimpan. Adapun komposisi bahan pada pembuatan sosis sebagai berikut:
Tabel 3. Komposisi Bahan-bahan pada Pembuatan Sosis Taraf Perlakuan Bahan Kontrol Nitrit 0,3% Bakteriosin 0,3% Daging segar (g) 1000 1000 1000 Lemak daging (g) 200 200 200 Minyak (g) 100 100 100 Susu skim bubuk (g) 100 100 100 Tepung tapioka (g) 150 150 150 Garam (g) 35 35 35 STTP (g) 8 8 8 Es (g) 400 400 400 Bawang putih (g) 15 15 15 Merica (g) 10 10 10 Jahe (g) 5 5 5 Biji Pala (g) 5 5 5 Nitrit (g) 0 3 0 Bakteriosin (g) 0 0 3 Berikut adalah diagram alir proses pembuatan sosis: Daging garam, STTP, bahan pengawet dan sepertiga bagian es digiling Ditambahkan susu skim, bumbu, lemak, minyak dan sepertiga bagian es Tepung tapioka dan sepertiga bagian es Digiling hingga kalis, dimasukkan ke casing dan dikukus pada suhu 60-70 C selama 45 menit Sosis dikemas dan disimpan Gambar 2. Bagan Pembuatan Sosis Daging Sapi 19
Tahap 3. Analisis Kualitas Mikrobiologis Sebelum dilakukan analisis mikrobiologis, sampel dipersiapkan terlebih dahulu dengan cara sebagai berikut yaitu sebanyak 25 g sampel dimasukkan ke dalam plastik steril lalu ditambahkan 225 ml larutan pengencer steril, kemudian dihancurkan dengan alat blender hingga diperoleh campuran yang homogen dengan konsentrasi 0,1 g/ml. Sampel yang akan diuji yaitu daging segar dan sosis yang telah diberi perlakuan. Sebelum daging diproduksi menjadi sosis, dilakukan pengujian untuk daging segar yaitu pengujian angka kuantitatif Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella, dan Total Plate Count. Setelah sosis diberi perlakuan maka dilakukan pengujian yang sama seperti pada daging segar. Sampel kemudian diencerkan dengan larutan pengencer sesuai dengan kebutuhan dan siap untuk diinkubasi ke dalam cawan. Setelah diinkubasi kurang lebih 24 jam, maka pembacaan dan perhitungan jumlah bakteri pada cawan dilakukan. Analisis Kuantitatif Staphylococcus aureus (Bacteriological Analytical Manual, 2006). Sebanyak masing-masing 25 g sampel sosis ditambahkan 225 ml NaCl 0,85% steril, kemudian dikocok diremas-remas hingga diperoleh campuran yang homogen. Sampel ini kemudian diencerkan dengan NaCl 0,85% hingga pengenceran ketiga (P -3 ). Sampel hasi pengenceran sebanyak masing-masing 1 ml dari tiap pengenceran yang dikehendaki (P -1 sampai P -3 ) dipupukkan ke dalam cawan petri steril, selanjutnya dituangi dengan media tumbuh Baird Parker Agar (BPA), telurit dan kuning telur. Media tumbuh dituangkan terlebih dahulu kedalam cawan hingga mengeras, kemudian ditambahkan dengan setiap pengenceran. Kemudian diratakan dengan alat hockey stick. Koloni Staphylococcus aureus berwarna hitam dikelilingi kuning. Analisis Kuantitatif Escherichia coli (Bacteriological Analytical Manual, 2006). Sebanyak masing-masing 25 g sampel sosis ditambahkan 225 ml NaCl 0,85% steril, kemudian dikocok diremas-remas hingga diperoleh campuran yang homogen. Sampel ini kemudian diencerkan dengan NaCl 0,85% hingga pengenceran ketiga (P - 3 ). Sampel hasil pengenceran sebanyak masing-masing 1 ml dari tiap pengenceran yang dikehendaki (P -1 sampai P -3 ) dipupukkan ke dalam cawan petri steril, 20
selanjutnya dituangi dengan media. Sampel dipupukkan ke dalam cawan yang telah berisi media Eosyn Methylen Blue Agar (EMBA). Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu 37 o C, koloni E. coli yang tumbuh akan berwarna biru keunguan. Analisis Kuantitatif Salmonella spp. (Bacteriological Analytical Manual, 2006) Sebanyak masing-masing 25 g sampel sosis ditambahkan 225 ml NaCl 0,85% steril, kemudian dikocok diremas-remas hingga diperoleh campuran yang homogen. Sampel ini kemudian diencerkan dengan NaCl 0,85% hingga pengenceran ketiga (P -3 ). Kemudian sebanyak masing-masing 1 ml dari tiap pengenceran yang dikehendaki (P -1 sampai P -3 ) dipupukkan ke dalam cawan petri steril, selanjutnya dituangi dengan media XLDA lebih kurang 15 ml dan dihomogenkan dengan cara cawan diputar membentuk angka 8. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 o C selama 24 jam, koloni yang tumbuh berwarna kuning keruh dengan titik hitam ditengah dihitung. Total Plate Count (Dewan Standardisasi Nasional, 1995). Sebanyak 25 g sampel sosis dimasukkan ke dalam plastik steril lalu ditambahkan 225 ml NaCl 0,85% steril, kemudian dikocok diremas-remas hingga diperoleh campuran yang homogen. Sampel ini kemudian diencerkan dengan NaCl 0,85% hingga pengenceran keenam (P -6 ). Sampel dipipet secara aseptik pada pengenceran P -4 sampai P -6 dan sebanyak 1 ml dipipet ke dalam cawan petri steril dan tuang media plate count agar (PCA) sebanyak 10-12 ml. Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu 37 o C dengan posisi terbalik. Jumlah bakteri ditentukan dengan metode hitungan cawan dan formula penentuan jumlah koloni pada setiap perlakuan dengan jumlah koloni antara 25-250 cfu/g adalah: N = x d Penyimpanan Sosis Sosis disimpan selama 9 hari pada di suhu 4-6 C. Pengujian untuk mengetahui kualitas simpan dilakukan setiap 3 hari sekali ( hari ke-0, 3, 6, dan 9). Uji yang dilakukan untuk menentukan total mikrobiologi yang terdapat dalam sosis yang telah disimpan pada hari yang berbeda. 21
Rancangan Percobaan dan Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian aplikasi bakteriosin pada produk sosis adalah rancangan acak lengkap (RAL) faktorial dengan pola 3 x 4 dengan dua faktor dan tiga kali ulangan. Faktor pertama adalah pemberian pengawet (0%, bakteriosin 0,3% dan nitrit 0,3%). Faktor kedua adalah lama penyimpanan 0, 3, 6, dan 9 hari pada suhu refrigerator (4 C). Model Matematika yang digunakan pada penelitian ini adalah : Y ijk = µ + P i + Y j + PY ij + ijk Keterangan : Yijk = Variabel respon akibat pengaruh bakteriosin ke-i dan lama penyimpanan ke- j pada ulangan ke-k. μ = nilai tengah umum P i Y j PY ij = Pengaruh perlakuan pengawet ke-i = Pengaruh perlakuan umur penyimpanan ke-j = Pengaruh interaksi antara bakteriosin ke-i dengan umur penyimpanan ke-j ij = Pengaruh galat perlakuan ke-i dan ke-j, terhadap ulangan ke-k, k= 1, 2, 3 Data diolah dengan analisis ragam (analysis of variance = ANOVA). Jika pada analisis ragam perlakuan menunjukkan pengaruh yang nyata, maka dilanjutkan dengan uji Duncan (Steel dan Torrie, 1995). 22