MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Bagian Pemuliaan dan Genetika Ternak, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. penelitian ini dilakukan pada bulan Juni - Agustus 2012 Materi Sampel Darah Sampel darah sapi yang digunakan yaitu sapi asli dan sapi lokal sebanyak 18 sampel dari lima bangsa sapi yang yaitu sapi Bali, Madura, Pesisir, Aceh, dan PO. Jumlah masing-masing sampel yang digunakan dalam penelitian ini disajikan pada Tabel 1. Tabel 1. Jumah Sampel Darah Ternak Sapi Indonesia Ternak n Asal Sapi Bali 2 4 BIB Sapi Bali, Bali BPTU Sapi Bali, Bali Sapi Madura 2 2 Sapudi Kab. Sampang Sapi Aceh 2 Kab. Aceh Besar Sapi Pesisir 2 Kab. Pesisir Selatan Sapi PO 2 2 Kab. Kebumen Kandang A Fakultas Peternakan IPB Total 18 Keterangan : n = jumlah individu sampel Alat dan Bahan Bahan yang digunakan pada pengambilan sampel darah adalah alkohol 70%, es, dan kapas. Alat yang digunakan antara lain jarum venojact, tabung vacutainer 10 ml, dan termos. Sampel darah yang digunakan merupakan koleksi dari laboratorium Pemuliaan dan Genetika Molekuler, Bagian Pemuliaan dan Genetika Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan. 15
Amplifikasi daerah D-loop dilakukan melalui Polymerase Chain Reaction (PCR). Bahan-bahan yang digunakan pada proses amplifikasi DNA adalah adalah DW, sampel DNA, 10 buffer, MgCl 2, primer forward dan reverse, enzim taq,dan dntps. Alat yang digunakan adalah satu set pipet mikro, alat sentrifugasi, tabung PCR, mesin PCR, vortex, dan freezer. Bahan yang digunakan untuk elektroforesis terdiri atas gel elektroforesis, loading dye, dan marker 100 pb. Bahan-bahan yang digunakan untuk membuat gel elektroforesis yaitu agarose, 0,5 TBE, Ethidium Bromide. Bahan-bahan yang digunakan untuk membuat larutan loading dye yaitu bromothymol blue, xylene cyanol, gliserol. Sementara, alat yang digunakan antara lain microwave, stearer, magnet stearer, gelas ukur, tabung erlenmeyer, gel tray, pencetak untuk sumur (comb), power supply 100 volt, gelas ukur, pipet makro dan mikro, serta UV- Transiluminator. Buffer elektroda yang digunakan terdiri dari Tris, Glycine dan aquadestilata. Primer DNA Mitokondria Daerah D-loop Primer merupakan molekul oligonukleotida yang berukuran pendek (sekitar 18-24 pasang basa) yang akan menempel pada DNA cetakan di tempat spesifik. Pasangan primer yang digunakan untuk mengamplifikasi mtdna daerah D-loop sapi dengan runutan primer forward5 -TAGTGCTAATACCAACGGCC-3 dan primer reverse5 -AGGCATTTTCAGTGCCTTGC-3 (Hassan et al., 2009). Prosedur Pengambilan Sampel Darah Pengambilan sampel darah sapi sebanyak sekitar 3 ml melalui vena jugularis dengan menggunakan venojact lalu segera dimasukkan ke dalam tabung vaccutainer yang dimasukkan kedalam termos es dan disimpan dalam suhu 4 ºC. Isolasi DNA Isolasi DNA dilakukan dari sampel darah dengan menggunakan Genomic DNA mini kit Geneaid (Lampiran 2) yang dimodifikasi untuk penggunaan sampel yang disimpan dalam alkohol. 16
Amplifikasi DNA Mitokondria Daerah D-loop Amplifikasi lengkap fragmen D-loop DNA mitokondria menggunakan primer seperti yang digunakan Hassan et al. (2009), yaitu primer Forward 5 - TAGTGCTAATACCAACGGCC-3 dan primer Reverse 5 - AGGCATTTTCAGTGCCTTGC-3 dengan panjang produk PCR 1145 bp (Gambar 10). Sekuen D-loop mtdna diperoleh dari NBCI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Nomor akses standardnya adalah Bos indicus dengan kode akses AY126697. 5 TAGTACTAATACCAACAGCCGGCACAGTTGAAAACAAATTACTAAAATGAAGACAGGTCTTTGTAGTACATCTAA TATACTGGTCTTGTAAACCAGAGAAGGAGAACAACTAACCTCCCTAAGACTCAAGGAAGAAACTGTAGTCTCACCGTC AACCCCCAAAGCTGAAGTTCTATTTAAACTATTCCCTGAACACTATTAATATAGTTCCATAAATGCAAAGAGCCTTAT CAGTATTAAATTTATCAAAAATCCCAATAACTCAACACAGAATTTGCACCCTAACCAAATATTACAAACACCACTAGC TAACATAACACGCCCATACACAGACCACAGAATGAATTACCCAGGCAAGAGGTAATGTACATAACATTAATGTAATAA AGACATGATATGTATATAGTACATTAAATTATATACCCCATGCATATAAGCAAGTACATGATCTCTATAATAGTACAT AATACATACAATTATTAATTGTACATAGTACATTATATCAAATCCATCCTCAACAACATATCTACTATATACCCCTTC CACTAGATCACGAGCTTAATTACCATGCCGCGTGAAACCAGCAACCCGCTAAGCAGAGGATCCCTCTTCTCGCTCCGG GCCCATAGACCGTGGGGGTCGCTATTTAATGAATTTTACCAGGCATCTGGTTCTTTCTTCAGGGCCATCTCATCTAAA GTGGTCCATTCTTTCCTCTTAAATAAGACATCTCGATGGACTAATGACTAATCAGCCCATGCTCACACATAACTGTGC TGTCATACATTTGGTATTTTTTTATTTTGGGGGATGCTTGGACTCAGCTATGGCCGTCAAAGGCCCCGACCCGGAGCA TCTATTGTAGCTGGACTTAACTGCATCTTGAGCACCAGCATAATGATAGGCATGGGCATTACAGTCAATGGTCACAGG ACATAAATACATTATATATCCCCCCCTTCATAAAAACCTCCCCCTTAAATATTCACCACCACTTTTAACAGACTTTTC CCTAGATACTTATTTAAATTTTCCACACTTTCAATACTCAATTTAGCACTCCAAACAAAGTCAATATATAAACGCAGG CCCCCCCCCCCCCCGTTGATGTAGCTTAACCCAAAGCAAGGCACTGAAAATGCCT-3 Keterangan : : Primer forward : Primer reverse Warna hijau menunjukkan basa nukleotida yang berbeda Gambar 10. Situs Penempelan Primer Sekuen D-Loop DNA Mitokondria Sapi Volume setiap reaksi PCR sebanyak 25 µl yang terdiri atas 2 µl sampel DNA; 0,3 µl primer forward dan reverse; 0,2 µl dntps; 1 µl MgCl 2 ; 2,5 µl 10 buffer0,1 µl enzim Taq Polymerase; dan 18,9 µl destilation water (DW) yang dilakukan dengan menggunakan mesin PCR model Applied Biosystems. Kondisi PCR yang digunakan adalah: predenaturasi pada suhu 95 C selama lima menit, dilanjutkan dengan siklus utama yaitu tahap denaturasi pada suhu 95 C selama 30 detik, tahap penempelan primer (annealing) pada suhu 60 C selama 45 detik, dan tahap polimerasi (extension) pada suhu 72 C selama satu menit diulang sebanyak 35 siklus. Reaksi PCR diakhiri dengan polimerasi (final exstension) pada suhu 72 C selama lima menit. 17
Elektroforesis Elektroforesis menggunakan agarose 1,5% dilakukan dengan cara 0,45 g agarose dilarutkan dalam larutan 0,5 x TBE sebanyak 30 ml lalu dipanaskan dalam microwave selama sekitar lima menit kemudian dilakukan stirer dan ditambahkan 2,5 µl EtBr. Larutan dituang ke dalam cetakan gel, diberi sisiran pada tepi gel dan gel dibiarkan mengeras. Sisir dicabut setelah gel mengeras sehingga terbentuk sumur-sumur. Produk PCR sebanyak lima µl dicampurkan dengan loading dye sebanyak satu µl dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan dalam sumur-sumur gel dan satu sumur gel dimasukkan marker sebanyak 2 µl yang digunakan sebagai penanda. Kemudian gel ditempatkan ke dalam gel tray elektroforesis yang sudah berisi larutan buffer dan dialiri listrik 100 volt selama 30 menit, molekul DNA yang bermuatan negatif pada ph netral akan bergerak (bermigrasi) ke arah positif. Gel agarose yang telah selesai dilakukan elektoforesis kemudian diambil untuk melihat panjang pita DNA dengan menggunakan sinar ultraviolet dalam trans illuminator. Panjang pita DNA dapat diketahui dengan cara menarik garis lurus masing-masing pita sampel DNA dengan posisi pita DNA marker. Perunutan Produk PCR (Sekuensing) Pebacaan sekuen menjadi alat penting dan utama dalam biologi molekular karena dapat mengetahui komposisi nukleotida dan asam amino suatu gen, juga digunakan untuk menganalisis kekerabatan dan jalur evolusi (Albert et al., 1994). Produk PCR daerah D-loop dari penelitian ini berupa pita tunggal yang berukuran 1145 pb. Analisis perunutan dilakukan di Macrogen, Korea Selatan. Rancangan dan Analisis Data Jarak Genetik dan Pohon Filogeni Sekuen DNA dilakukan manual editing dengan menggunakan BioEdit. Runutan nukleotida yang telah diedit disejajarkan dengan runutan baku nukleotida B. indicus dari Genbank (kode akses AY126697; Mirreti et al., 2002). Proses pensejajaran (alignment) dilakukan dengan menggunakan program Clustal W yang terdapat pada program MEGA 5.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis 5.0; 18
Tamura et a., 2007). Perhitungan komposisi basa nukleotida, jarak genetik dan konstruksi pohon filogeni dilakukan dengan menggunakan program MEGA 5.0. Jarak genetik digunakan untuk melihat kedekatan hubungan genetik antara sampel yang dianalisis. Nilai jarak genetik diperoleh dengan membagi jumlah nukleotida yang berbeda degan jumlah total nukleotida. Perhitungan pairwise distance digunakan untuk melihat jarak rata-rata p-distance dari basa nukleotida daerah D- loop. Pohon filogeni direkrontruksi dengan menggunakan metode bootsraped Neighboor-Joining (NJ) dengan 1000 kali pengulangan (Nei dan Kumar, 2000). 19