digilib.uns.ac.id BAB III METODE PENELITIAN A. Kategori Penelitian Penelitian ini menggunakan metode eksperimental dekskriptif. Metode yang digunakan untuk mengekstraksi kandungan kimia dalam daun awar-awar adalah dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 95%. Ekstrak yang diperoleh diuji aktivitas antibakterinya dengan metode difusi padat dan dilakukan skrining fitokimia untuk mengidentifikasi senyawa kimia yang terkandung dalam ekstrak etanolik daun awar-awar. B. Variabel penelitian 1. Variabel bebas : konsentrasi ekstrak etanol daun awar-awar 2. Variabel tergantung : diameter daya hambat 3. Variabel terkendali : suhu dan waktu inkubasai, kondisi steril, media tumbuh, kultur bakteri C. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan selama 1 bulan di Laboratorium Biologi Pusat Sub Lab Mikrobiologi UNS dan Laboratorium Teknologi Farmasi FMIPA UNS. D. Alat dan Bahan 1. Alat yang digunakan a. Alat Penyarian Seperangkat alat maserasi, oven (Celculrate CO 2 Incubator), mortir, stamper, timbangan analit, bejana kaca, pengaduk kayu, kertas saring, ayakan nomor 44, kain flannel, batang pengaduk, rotary evaporator (Buchi B-480), 17
digilib.uns.ac.id 18 waterbath (Haake DL 30), eksikator, gelas beker, gelas ukur, labu ukur, kaca arloji. b. Alat Uji aktivitas Antibakteri Tabung reaksi, rak tabung reaksi, cawan petri, jarum ose, yellow tips, mikro pipet 20μL-200μL (Master ptt ), bunsen burner, gelas ukur, pipet tetes, pelubang gabus, autoklaf (Sturdy ), pipet ukur, Laminar Air Flow (LAF) cabinet (Labconco ), spreader glass, inkubator (Incubatot Hotcold- M), jangka sorong, kulkas, neraca analit (Mettler Toledo ), ot-plate (IKA Labortechnick), dan shaker (IKA Labortechnick). 2. Bahan yang Digunakan a. Bahan ekstraksi Daun Awar-awar (Ficus septica Burm.) yang diperoleh dari kabupaten klaten, etanol 95% dan kain flanel. b. Uji antibakteri Ekstrak etanol daun awar-awar, aquades steril, media MHA (Muller Hilton Agar), etanol 95%, dimetil sulfoksida (DMSO), larutan standar Mc farlan 0.5, dan disc antibiotik Ciprofloxacin 5μg. c. Bakteri Uji Bakteri yang digunakan untuk uji ini adalah bakteri Staphylococcus epidermidis yang diperoleh dari Laboratorium Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta
digilib.uns.ac.id 19 d. Bahan untuk uji Bahan yang digunakan untuk uji tabung adalah ekstrak etanolik daun awar-awar, aquades, kertas saring, larutan HCl 2 N, HCl 2%, pereaksi meyer, pereaksi dragendorf, larutan FeCl 3, serbuk Mg dan amil alkohol. E. Cara Kerja Tahap dari penelitian ini meliputi penyiapan alat, determinasi dan preparasi sampel, pembuatan ekstrak etanol daun awar-awar (Ficus septica Burm.), dan uji aktivitas antibakteri secara in vitro dengan metode difusi padat. 1. Determinasi Langkah ini bertujuan untuk memastikan kebenaran sampel daun awar-awar, dengan mencocokkan ciri-ciri morfologis yang ada pada daun awar-awar terhadap kepustakaan yang dibuktikan oleh Laboratorium Biologi Farmasi Universitas Muhammdiyah Surakarta. 2. Preparasi Sampel Daun awar-awar disortasi basah (dipisahkan dari pengotor), diambil, dicuci di bawah air mengalir, dijemur dan dikeringkan di bawah sinar matahari dilapisi dengan kain hitam atau dioven pada suhu kurang dari 50ºC. Selanjutnya, simplisia dipisahkan dari pengotor (sortasi kering). Kemudian diserbuk dengan cara digerus di mortir dan diayak dengan derajat kehalusan tertentu dinyatakan dengan nomor pengayak yaitu pada 4/18 mesh. 3. Ekstraksi Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi yakni serbuk simplisia dun awar-awar sebanyak 250 gram dimasukkan dalam bejana dan
digilib.uns.ac.id 20 direndam dalam pelarut etanol 95% sebanyak 1,25 liter selama 3 hari sambil diaduk. Hasil maserasi (maserat) disaring dengan menggunakan kain flanel., kemudian residu dari maserasi di remaserasi dengan etanol 95% selama 2 hari sambil di aduk. Hasil remaserasi disaring dengan kain flanel dan dijadikan satu dengan filtrat hasil maserasi. Kemudian filtrat (ekstrak) yang didapat dipekatkan dengan rotary evaporator hingga seluruh pelarut terbuang. Setelah itu diuapkan dengan menggunakan waterbath sampai didapatkan ekstrak kental. Ekstrak kemudian ditimbang dan disimpan di dalam eksikator. 4. Uji Aktivitas Antibakteri Langkah-langkah pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun awar-awar adalah sebagai berikut : a. Penyiapan alat Alat uji yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121ºC, tekanan 1 atm selama 15 menit. b. Pembuatan Media MHA (Muller Hinton Agar) Media MHA dibuat dengan cara sebanyak 34 gram bubuk media MHA dilarutkan dalam aquades, sampai volume 1 liter. Larutan dipanaskan hingga larut, selanjutnya dimasukkan kedalam erlenmeyer dan dilakukan sterilisasi. c. Pembuatan Stok Bakteri Uji 1) Menyiapkan biakkan kultur bakteri uji dalam tabung reaksi. 2) Menyiapkan media MHA dalam cawan petri.
digilib.uns.ac.id 21 3) Memindahkan kultur bakteri uji setelah kultur berusia 24 jam ke dalam media MHA dengan metode straight. Diinkubasi selama 24jam dalam suhu 35-37 o C dan digunakan sebagai stok. d. Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Awar-awar. Ekstrak etanol daun awar-awar (Ficus septica Burm.) dibuat konsentrasi dengan menggunakan DMSO. Setiap seri konsentrasi dibuat dengan menambahkan DMSO kedalam beberapa gram ekstrak etanol daun awar-awar, sampai volume 2 ml. Komposisi bahan yang digunakan dalam pembuatan seri konsentrasi ekstrak etanol daun awar-awar (dapat dilihat dalam Tabel I. Tabel 1. Komposisi Bahan dalam Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Awar-Awar (Ficus septica Burm.) Konsentrasi Berat Ekstrak Etanol DMSO Akhir Ekstrak Daun Awar-Awar (ml) (%) (gram) 0 0 sampai 2 10 0,2 sampai 2 20 0,4 sampai 2 30 0,6 sampai 2 40 0,8 sampai 2 50 1,0 sampai 2 60 1,2 sampai 2 70 1,4 sampai 2 80 1,6 sampai 2 90 1,8 sampai 2 e. Pembuatan Larutan Kontrol Kontrol yang dipakai pada uji aktivitas antibakteri ekstrak etanolik daun awar-awar terhadap Staphylococcus epidermidis adalah : 1) Kontrol DMSO 2) Kontrol larutan etanol 95%
digilib.uns.ac.id 22 3) Kontrol disc antibiotik Ciprofloxacin 5μg. f. Pembuatan Suspensi Standar Mc. Farland 0,5 Suspensi standar Mc. Farland adalah suspensi yang menunjukkan konsentrasi kekeruhan bakteri sama dengan 1,5x10 8 CFU/ml. Komposisi : Larutan asam sulfat 1 % b/v 9,5 ml Larutan barium klorida v/v 0,5 ml Cara Pembuatan : Dicampur kedua larutan tersebut dalam tabung reaksi dikocok dan dihomogenkan. Apabila kekeruhan suspensi bakteri uji adalah sama dengan kekeruhan suspensi standart, berarti konsentrasi suspensi bakteri adalah 1,5x10 8 CFU/ml g. Pengujian Aktivitas Antibakteri 1) Membiakkan mikroba dari stok dalam media NA, kemudian diinkubasi pada 35-37 C selama 18-24 jam. 2) Menyiapkan media uji MHA disterilisasi pada suhu 121 C kemudian dimasukkan cawan petri sebanyak 25 ml dan dibiarkan hingga memadat. 3) Mikroba uji yang berusia 18-24 jam dipindahkan ke dalam larutan NaCl steril dan distandarkan dengan larutan Mc Farlan 0,5. 4) Suspensi bakteri yang telah sesuai dengan larutan Mc Farlan dipindahkan ke MHA yang telah padat dengan metode swab menggunakan kapas lidi steril.
digilib.uns.ac.id 23 5) Membuat lubang sumuran dengan menggunakan pelubang gabus pada media MHA padat. 6) Memasukkan 25 µl seri konsentrasi ekstrak ke dalam masing-masing lubang, kemudian diberi label dan diinkubasi pada suhu 35-37 C selama 24 jam. Sebagai kontrol digunakan disc antibiotik Ciprofloxacin 5μg. 7) Mengukur diameter zona hambat dengan replikasi sebanyak 3 kali tiap-tiap lubang. Kemudian nilai diameter zona hambat dirata-rata. 5. Identifikasi kandungan senyawa kimia daun awar-awar a. Uji alkaloid Menambahkan larutan HCl 2% dalam ekstrak, kemudian membagi larutan dalam 2 tabung. Selanjutnya menambahkan reagen dragendorf dalam tabung 1 dan reagen mayer dalam tabung 2. Terbentuk endapan jingga pada tabung 1 dan endapan putih pada tabung 2 menunjukan adanya alkaloid. b. Uji saponin Melarutkan ekstrak dengan aquades kemudian memanaskan larutan dengan penangas air. Setelah dingin, mengocok larutan dalam tabung reaksi dengan kuat-kuat salama 30 detik. Terbentuknya Busa yang konstan selama beberapa menit menunjukan hasil positif dan dengan penambahan beberapa HCl encer masih terbentuk busa.
digilib.uns.ac.id 24 c. Uji flavonoid Menambahkan ekstrak dengan serbuk Mg dan HCl 2 N kemudian memanaskan di atas penangas air. Setelah itu menambahkan amil alkohol, dikocok hingga tercampur rata. Hasil positif ditunjukan adanya tertariknya warna kuning-merah pada lapisan alkohol. d. Tanin Memasukkan sejumlah sampel dengan 10ml air suling, menyaring campuran kemudian mengencerkan filtrat yang terbentuk dengan air suling sampai tidak berwarna. Mengambil 2 ml larutan lalu ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi (III) klorida. Terjadi biru atau hijau kehitaman menunjukan adanya tanin (Farnsworth, 1966). F. Teknik Pengumpulan dan Analisis Data Pada tahap pengujian aktivitas antibakteri ekstrak akan diperoleh data diameter daya hambat untuk bakteri uji pada berbagai konsentrasi tertentu. Daya hambat ekstrak dilihat dari besar kecilnya diameter zona hambat pertumbuhan dari bakteri Staphylococcus epidermidis. Semakin besar diameter zona hambat menunjukan aktivitas antibakteri ekstrak etanolik daun awar-awar semakin besar. Hasil uji tabung akan diperoleh data berupa kandungan kimia yang terkandung dalam daun awar-awar.