15 3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan dari bulan Januari sampai bulan Mei 2010. Tempat penelitian di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku, Laboratorium Bioteknologi dan Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Laboratorium Biologi Hewan, Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan antara lain pisau, bak, timbangan digital, timbangan analitik, sudip, aluminium foil, gegep, kompor listrik, cawan porselen, oven, desikator, tanur pengabuan, labu kjehdal, kondensor, buret, corong Buchner, gelas ukur, gelas piala, corong terpisah, vortex, erlenmeyer, kapas, alat soxhlet, shaker, kertas saring Whatman 42, vakum evaporator, botol ekstrak, freezer, tabung reaksi, pipet tetes, pipet volumetrik, kompor listrik, pipet mikro, inkubator, dan spektrofotometer UV-VIS Hitachi U-2800. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas bahan utama dan bahan pembantu. Bahan utama dalam penelitian ini yaitu daun dan batang semanggi air (Marsillea crenata). Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk analisis proksimat meliputi akuades, kristal K 2 SO 4, kjeltab jenis HgO, larutan H 2 SO 4 pekat, larutan H 2 O 2, asam borat (H 3 BO 3 ) 4% yang mengandung indikator bromcherosol green 0,1% dan methyl red 0,1% (2:1), larutan NaOH-Na 2 S 2 O 3, larutan HCl 0,2 N, pelarut lemak (n-heksana), larutan HCl 10%, larutan AgNO 3 0,1N, larutan H 2 SO 4 1,25%, dan larutan NaOH 1,25%. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk uji aktivitas antioksidan yaitu ekstrak semanggi air, kristal 1,1- difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), metanol, antioksidan sintetik BHT (Butylated Hydroxytoluena) sebagai pembanding. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk uji fitokimia meliputi pereaksi Wagner, pereaksi Meyer, pereaksi Dragendroff (uji alkaloid), kloroform, anhidrat asetat, asam sulfat pekat (uji steroid), serbuk magnesium, amil alkohol (uji flavonoid), air panas, larutan HCl 2 N (uji saponin), etanol 70%, larutan FeCl 3 5% (uji fenol hidrokuinon), peraksi Molisch, asam 15
16 sulfat pekat (uji Molisch), pereaksi Benedict (uji Benedict), pereaksi Biuret (uji Biuret), dan larutan Ninhidrin 0,1% (uji Ninhidrin). 3.3 Metode Penelitian Penelitian ini diawali dengan penanaman semanggi air (Marsilea crenata) selama 3 minggu. Setelah itu, dilakukan pemetikan daun dan batang semanggi air, analisis proksimat, ekstraksi komponen antioksidan dan uji komponen fitokimia. 3.3.1 Analisis proksimat Analisis proksimat adalah suatu analisis yang dilakukan untuk mengetahui komposisi kimia yang ada pada suatu bahan. Analisis proksimat yang dilakukan meliputi : analisis kadar air, lemak, protein, abu, dan serat kasar. 1). Analisis kadar air (AOAC 2005) Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 105 o C selama 1 jam. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (kurang lebih 15 menit) dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Cawan tersebut ditimbang kembali hingga beratnya konstan. Sebanyak 5 gram contoh dimasukkan ke dalam cawan tersebut, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 105 o C selama 5 jam atau hingga beratnya konstan. Setelah selesai, cawan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam desikator dan dibiarkan sampai dingin dan selanjutnya ditimbang kembali. Perhitungan kadar air: 2). Analisis kadar lemak (AOAC 2005) Contoh seberat 5 gram (W 1 ) dimasukkan ke dalam kertas saring pada kedua ujung bungkus ditutup dengan kapas bebas lemak dan selanjutnya dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian sampel yang telah dibungkus dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W 2 ) dan disambungkan dengan tabung Soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam 16
17 ruang ekstraktor tabung Soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak (n-heksana p.a.). Kemudian dilakukan refluks selama 6 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 o C, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan (W 3 ). Perhitungan kadar lemak: Keterangan : W 1 W 2 W 3 = Berat sampel (gram) = Berat labu lemak kosong (gram) = Berat labu lemak dengan lemak (gram) 3). Analisis kadar protein (AOAC 1980) Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap yaitu destruksi, destilasi dan titrasi. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan metode mikro Kjeldahl. Sampel ditimbang sebanyak 0,25 gram, kemudian dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 100 ml, lalu ditambahkan 0,25 gram selenium dan 3 ml H 2 SO 4 p.a. pekat. Contoh didestruksi pada suhu 410 o C selama kurang lebih 1 jam sampai larutan jernih lalu didinginkan. Setelah dingin, ke dalam labu Kjeldahl ditambahkan 50 ml akuades dan 20 ml NaOH 40%, kemudian dilakukan proses destilasi dengan suhu destilator 100 o C. Hasil destilasi ditampung dalam labu Erlenmeyer 125 ml yang berisi campuran 10 ml asam borat (H 3 BO 3 ) 2% dan 2 tetes indikator bromcherosol green-methyl red yang berwarna merah muda (1:2). Setelah volume destilat mencapai 40 ml dan berwarna hijau kebiruan, maka proses destilasi dihentikan. Lalu destilat dititrasi dengan HCl 0,10 N sampai terjadi perubahan warna merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat. Larutan blanko dianalisis seperti contoh. Kadar protein dihitung dengan rumus sebagai berikut : *) Faktor koreksi alat = 2,5 17
18 *) Faktor Konversi = 6,25 4). Analisis kadar abu (AOAC 2005) Cawan pengabuan dikeringkan di dalam oven selama 1 jam pada suhu 105 o C, kemudian didinginkan selama 15 menit di dalam desikator dan ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Sampel sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam cawan pengabuan dan dipijarkan di atas nyala api hingga tidak berasap lagi. Setelah itu, dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600 o C selama 1 jam, kemudian ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Kadar abu ditentukan dengan rumus: 5). Analisis kadar serat kasar (AOAC 1995) Sebanyak 1 gram sampel kering dilarutkan dengan 100 ml H 2 SO 4 1,25%, dipanaskan hingga mendidih lalu dilanjutkan dengan destruksi selama 30 menit. Kemudian disaring menggunakan kertas saring Whatman (ф: 10 cm) dan dengan bantuan corong Buchner. Residu hasil saringan dibilas dengan 20-30 ml air mendidih dan dengan 25 ml air sebanyak 3 kali. Residu didekstruksi kembali dengan 100 ml NaOH 1,25% selama 30 menit. Lalu disaring dengan cara seperti diatas dan dibilas berturut-turut dengan 25 ml H 2 SO 4 1,25% mendidih 2,5 ml air sebanyak tiga kalidan 25 ml alkohol. Residu beserta keras saring dipindahkan ke cawan porselin dan dikeringkan dalam oven 130 o C selama 2 jam setelah dingin residu beserta cawan porselin ditimbang (A), lalu dimasukkan dalam tanur 600 o C selama 30 menit, didinginkan dan ditimbang kembali (B). Penghitungan kadar serat kasar pada daun semanggi % Kadar serat kasar = bobot serat kasar x 100 % bobot sampel kering 18
19 3.3.2 Ekstraksi bahan aktif (Quinn 1988 dalam Darusman et al. 1995) Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode ekstraksi bertingkat (Quinn 1988 dalam Darusman et al. 1995). Metode ini digunakan tiga macam pelarut berdasarkan tingkat kepolarannya yaitu kloroform p.a. (non polar), etil asetat p.a. (semi polar), dan metanol p.a. (polar). Sampel semanggi air yang telah dipotong masing-masing sebanyak 25 g, dimaserasi menggunakan pelarut kloroform p.a terlebih dahulu sebanyak 100 ml selama 2x24 jam dengan diberi goyangan menggunakan orbital shaker 8 rpm. Hasil maserasi yang berupa larutan kemudian disaring dengan kertas saring Whatman 42 sehingga diperoleh filtrat dan residu. Residu yang dihasilkan selanjutnya dimaserasi dengan etil asetat p.a. sebanyak 100 ml selama 48 jam dengan diberi goyangan menggunakan orbital shaker 8 rpm, sedangkan filtrat ekstrak kloroform yang diperoleh dievaporasi hingga pelarut memisah dengan ekstrak menggunakan rotary vacuum evaporator pada suhu 50 o C. Hasil proses maserasi ke-2 selanjutnya disaring dengan kertas saring Whatman 42. Residu yang dihasilkan dimaserasi dalam pelarut metanol p.a. sebanyak 100 ml dan dimaserasi selama 48 jam dengan diberi goyangan menggunakan orbital shaker 8 rpm. Filtrat ekstrak etil asetat yang diperoleh dievaporasi sehingga semua pelarut terpisah dari ekstrak menggunakan rotary vacuum evaporator pada suhu 50 o C. Hasil maserasi ke-3 dengan pelarut metanol, disaring dengan kertas saring Whatman 42. Filtrat ekstrak metanol yang diperoleh dievaporasi sehingga semua pelarut terpisah dari ekstrak menggunakan rotary vacuum evaporator pada suhu 50 o C, sedangkan residu yang tersisa dibuang. Proses ini akan menghasilkan ekstrak kloroform, ekstrak etil asetat, dan ekstrak metanol yang kental. Proses ekstraksi bertingkat ini ditunjukkan pada Gambar 3. 19
20 Sampel daun dan batang segar Maserasi dengan kloroform selama 24 jam Penyaringan Filtrat Evaporasi Residu Ekstrak kloroform Maserasi dengan etil asetat selama 24 jam Penyaringan Filtrat Evaporasi Residu Ekstrak etil asetat Maserasi dengan metanol selama 24 jam Penyaringan Filtrat Evaporasi Residu Ekstrak metanol Gambar 3 Diagram alir proses ekstraksi semanggi air (Sumber: Quinn 1988 dalam Darusman et al. 1995) 3.3.3.1 Aktivitas antioksidan (DPPH) (Bois 1958 dalam Hanani et al. 2005) Ekstrak kasar semanggi air yang diperoleh dari ektrak bertingkat dengan kloroform, etil asetat, metanol akan dilarutkan dengan pelarut metanol dengan konsentrasi 200, 400, 600, dan 800 ppm. Antioksidan sintetik BHT digunakan sebagai pembanding dengan konsentrasi 2, 4, 6, dan 8 ppm. Larutan DPPH yang akan digunakan, dibuat dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 1 mm. Proses pembuatan larutan DPPH 1 mm dilakukan dalam kondisi suhu rendah dan terlindung dari cahaya matahari. Sebanyak 4,5 ml 20
21 larutan uji atau pembanding direaksikan dengan 500 µl larutan DPPH 1 mm dalam tabung reaksi. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit, kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS Hitachi U-2800 pada panjang gelombang 517 nm. Amrun dan Umiyah (2005) menyatakan bahwa absorbansi maksimum DPPH pada panjang gelombang 517 nm. Aktivitas antioksidan dari setiap sampel dan antioksidan pembanding BHT dinyatakan dengan persen inhibisi, yang dihitung dengan rumus sebagai berikut: Nilai konsentrasi sampel (ekstrak ataupun antioksidan pembanding BHT) dan persen inhibisinya diplot masing-masing pada sumbu x dan y pada persamaan regresi linear. Persamaan regresi linear yang diperoleh dalam bentuk persamaan y = a + bx, digunakan untuk mencari nilai IC 50 (inhibitor concentration 50%) dari setiap sampel dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x yang akan diperoleh sebagai IC 50. Nilai IC 50 menyatakan besarnya konsentrasi larutan sampel (ekstrak ataupun antioksidan pembanding BHT) yang dibutuhkan untuk mereduksi radikal bebas DPPH sebesar 50%. 3.3.3.2 Uji fitokimia (Harborne 1984) Uji fitokimia dilakukan untuk menentukan komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak kasar semanggi air setiap pelarut. Uji fitokimia yang dilakukan terdiri dari uji alkaloid, steroid/triterpenoid, flavonoid, saponin, fenol hidrokuinon, Molisch, Benedict, Biuret, dan Ninhidrin. Metode uji ini berdasarkan Harborne (1984). a). Uji Alkaloid Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid yaitu, pereaksi Dragendorff, pereaksi Meyer, dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, endapan coklat dengan pereaksi Wagner, dan endapan merah hingga jingga dengan pereaksi Dragendorff. Pereaksi Meyer dibuat dengan cara menambahkan 1,36 gram HgCl 2 dengan 0,50 gram KI lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 21
22 100 ml dengan labu takar. Pereaksi ini tidak berwarna. Pereaksi Wagner dibuat dengan cara 10 ml akuades dipipet kemudian ditambahkan 2,50 gram iodin dan 2 gram KI lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 200 ml dalam labu takar. Pereaksi ini berwarna coklat. Pereaksi Dragendorff dibuat dengan cara 0,80 gram bismut subnitrat ditambahkan dengan 10 ml asam asetat dan 40 ml air. Larutan ini dicampur dengan larutan yang dibuat dari 8 gram kalium iodida dalam 20 ml air. Sebelum digunakan, 1 volume campuran ini diencerkan dengan 2,30 volume campuran 20 ml asam asetat glasial dan 100 ml air. Pereaksi ini berwarna jingga. b). Uji Steroid/triterpenoid Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi. Anhridat asetat ditambahkan sebanyak 10 tetes kemudian ditambahkan asam sulfat pekat 3 tetes ke dalam campuran tersebut. Hasil uji positif mengandung steroid dan triterpenoid yaitu dengan terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau. c). Uji Flavonoid Sejumlah sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume yang sama) dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Hasil uji positif sampel mengandung flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol. d). Uji Saponin Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan adanya saponin. e). Uji Fenol hidrokuinan (pereaksi FeCl 3 ) Sejumlah sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70%. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl 3 5%. Hasil uji positif sampel mengandung Fenol hidrokuinan ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau atau hijau biru. 22
23 f). Uji Molisch Sebanyak 1 ml larutan sampel diberi 2 tetes pereaksi Molish dan 1 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Uji positif yang menunjukkan adanya karbohidrat ditandai terbentuknya kompleks berwarna ungu diantara 2 lapisan cairan. g). Uji Benedict Larutan sampel sebanyak 8 tetes dimasukkan ke dalam 5 ml pereaksi Benedict. Campuran dikocok dan dididihkan selama 5 menit. Hasil uji positif sampel mengandung gula pereduksi ditunjukkan dengan terbentuknya larutan berwarna hijau, kuning atau endapan merah bata. h). Uji Biuret Sebanyak 1 ml larutan sampel ditambahkan 4 ml pereaksi Biuret. Campuran dikocok dengan seksama. Hasil uji positif sampel mengandung senyawa peptida dengan terbentuknya larutan berwarna ungu. i). Uji Ninhidrin Sebanyak 2 ml larutan sampel ditambah beberapa tetes larutan ninhidrin 0,1%. Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Hasil uji positif sampel mengandung asam amino ditunjukkan dengan warna biru. 23