Penambahan krioprotektan dalam bahan pengencer untuk pembuatan semen beku melalui teknologi sederhana dalam menunjang pelaksanaan IB di daerah Yohan Rusiyantono Laboratorium Produksi Ternak Jurusan Peternakan Fakultas Pertanian Universitas Tadulako Palu Indonesia Abstract This study was designed to investigate the ability of glycerol or ethylene glycol or their combination as a cryoprotectant in maintaining the spermatozoa survival and motility rates and the plasma membrane integrity after having been freezed and thawed. Semen collected using a artificial vagina was macro and microscophically evaluated for its quality and the selected semen was placed in a medium containing either 5% glycerol, 5% ethylene glycol or 5% of their combination. The semen was then transferred into 0.25 ml straws before it was equilibrated at 5 C for 3 h. The semen was the steam freezed by placing it about 10 cm above liquid nitrogen for 15 m and stored in the liquid nitrogen. Thawing the semen was done by immensing it in water at 35 C for 30 sec. After thawing the sperm was checked for its survival, progressive motility and plasma membrane integrity. Results indicated that the combination of the glycerol and ethylene glycol had higher sperm survival rates (68%) compared to glycerol (65,6%) or ethylene glycol (64,8%). Sperm motility percentage was 45,2 ; 44,1and 47,2% for glycerol, ethylene glycol and its combination, respectively. The plasma membran integrity of 48,7% was found for the combination glycerol and ethylene glycol, but this was not different (P>0.05) from glycerol or ethylene glycol. It can be concluded that the combination of glycerol and ethylene glycol as an intracellular cryoprotectant provides the best protection to freezed spermatozoa. Key words : cryoprotectant, glycerol, ethylene glycol semen Pendahuluan Inserninasi Buatan (I.B) merupakan salah satu teknik yang memegang peranan penting dalam peningkatan populasi dan mutu genetic ternak, dimana peternak tidak perlu lagi memelihara pejantan karena biayanya cukup besar dan kualitas yang belum tentu baik. Pejantan yang berkualitas baik, cukup dipelihara di pusat-pusat IB dan semen beku yang dihasilkan dapat disebarluaskan sesuai dengan kebutuhan. Melalui teknik pembekuan, semen yang berasal dari pejantan berkualitas unggul dengan mudah didistribusikan ke seluruh pelosok daerah sehingga perkembangan populasi sapi dengan tingkat produksi dan kualitas dapat ditingkatkan secara nyata Boediono, 1995). Pusat IB sebagian besar didirikan di Pulau jawa,sedangkan Indonesia terdiri dari banyak Pulau yang berjauhan letaknya. Hal ini menjadi faktor kendala tersendiri dalam 160 Prosiding Seminar Nasionat Sapi Potong - Palu, 24 November 2008
pendistribusian semen beku yang diproduksi di pusat-pusat 1B. Kerusakan semen selama dalam perjalanan, mengakibatkan kegagalan dalam pelaksanaan IB di daerah. Oleh karena itu diperlukan pusat-pusat IB di daerah-daerah yang dapat memproduksi semen beku. Proses pembuatan semen beku sebaiknya dilakukan didaerah-daerah target. Yang menjadi masalah disini adalah tidak tersedianya alatlmesin pembeku dan teknologi pembekuan semen yang tepat guna. Dalam penelitian ini dilakukan pembekuan semen dengan menggunakan alat dan teknologi yang sangat sederhana, yang dapat diterapkan di daerah-daerah. Dalam proses pembekuan semen, diperlukan larutan pengencer yang dapat menjarnin kebutuhan fisik dan kimia sperma. Selama proses pembekuan akan terbentuk kristal-kristal es akibat perlakuan suhu yang sangat rendah (-196 C) disamping itu juga terjadi perubahan konsentrasi elektrolit yang dapat menyebabkan terjadinya kerusakan pada sel. Efek yang tidak menguntungkan bagi sperma ini dapat dikurangi dengan penambahan suatu senyawa krioprotektan ke dalam pengencer (Seidel, 1990). Menurut cara kerjanya, ada dua macam krioprotektan yang digunakan dalam proses pembekuan semen yaitu krioprotektan intraseluler dan ekstraseluler. Krioprotektan yang paling berperan penting dalam melindungi sel adalah intraseluler karena krioprotektan tersebut dapat menembus membran sel. Gliserol dan etilen glikol adalah salah satu krioprotektan intra seluler yang berfungsi memodifikasi pembentukan kristal es melalui pencegahan peningkatan konsentrasi elektrolit yang dapat membahayakan sel yang akan dibekukan. Gliserol merupakan krioprotektan yang sangat lazim digunakan dalam proses pembekuan sperma. Disamping gliserol dapat memodifikasi pemebentukan kristal es (Kumar et al., 1992), juga dapat mencegah pengumpulan molekul H20 dan kristalisasi es pada daerah titik beku larutan (Mazur, 1980). Sedangkan Etilen glikol merupakan salah satu krioprotektan yang telah dilaporkan keberhasilan dalam proses pembekuan yang lebih besar dari sperma, misalnya ovum (Rusiyantono, 2004). Konsentrasi krioprotektan yang optimal merupakan perpaduan antara jumlah yang dibutuhkan untuk perlindungan sel dan yang dibutuhkan agar larutan tidak toksis. Dalam penelitian ini, digunakan dua macam krioprotektan yaitu Gliserol atau Etilen Glikol serta kombinasi keduanya dalam berbagai dosis. Materi dan Metode Penampungan Semen Semen ditampung dari pejantan Unggul terpilih. Penampungan semen menggunakan vagina buatan yang dilakukan pada pagi hari, untuk menghindari pengaruh langsung sinar matahari. Periode penampungan dua kali seminggu. Segera setelah ditampung, dilakukan penilaian secara makroskopis meliputi : volume, warna, konsistensi (kekentalan), derajat keasaman (ph). Sedangkan pemeriksaan mikroskopis meliputi : gerakan massa, persentase motilitas, persentase sperma hidup, konsentrasi. Penilaian tersebut dimaksudkan untuk melihat kelayakan sperma untuk proses selanjutnya Pengenceran Semen Setelah dilperiksa secara makroskopis dan mikroskopis, semen yang memenuhi syarat akan dilakukan pengenceran. Persyaratan yang ditetapkan sebelumnya adalah : motilitas > 70 %, konsentrasi > 750 juta per ml, gerakan massa ++ atau +++ persentase abnormalitas < 20 %. Untuk mengetahui jumlah pengencer yang dibutuhkan, Rumus pengencerannya adalah sebagai berikut Prosiding Seminar Nasionat Sapi Potong - Palu, 24 November 2008 1 6 1
Volume semen x % mortalitas x konsentrasi Jumlah pengencer = 100 juta (dosis ) - volumen Tabel 1 Komposisi bahan penegencer yang digunakan dalam penelitian Keterangan : E = Etilin Glikol ; EG = Etilen Glikol dan Gliserol ; G = Gliserol Pembekuan Semen Bahan Semen yang telah diencerkan, disimpan dalam straw (jerami plastik) 0,25 ml dengan cara mengisapnya memakai mulut yang dihubungkan dengan pipa konektor, lalu dikemas dengan cara merekatkan ujungnya dengan pinset yang telah dipanaskan diatas bunsen dan kemudian diberi label. Temperatur diturunkan dari suhu kamar sampai 5 C selama 4 jam dalam satu tahap, hal ini dimaksudkan agar sperma diberi kesempatan untuk berekuilibrasi dengan krioprotektan. Straw selanjutnya diuapkan di uap nitrogen cair selama 15 menit. Kemudian dimasukkan dalam nitrogen cair dengan suhu - 196 C. Thawing semen beku Thawing dilakukan dengan cara menasukkan straw ke dalam air hangat bertemperatur ± 35 C selama 30 detik, kemudian dilakukan pengamatan berdasarkan peubah yang diamati. Peubah yang diamati Untuk mengukur kualitas pembekuan semen, maka dilakukan pengamatan terhadap motilitas, persentase sperma hidup dan mati, Keutuhan membran plasma. Rancangan Penelitian E Komposisi Tris (g) 3,87 3,87 3,87 Asam Sitrat (g) 2,17 2,17 2,17 Fruktosa (g) 1,56 1,56 1,56 Kuning telur (ml) 20,0 20,0 20,0 Krioprotektan 5,0 5,0 5,0 Penisilin (100.000 IU) 0,16 0,16 0,16 Streptomisin 0,10 0,10 0,10 Aquabides (ml) up to 100,0 100,0 100,0 Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan tiga perlakuan untuk masing-masing krioprotektan, dan jumlah penampungan merupakan ulangan. Data yang diperoleh dianalisa dengan menggunakan sidik ragam. EG G Hasil dan Pembahasan Persentase sperma hidup Salah satu keberhasilan proses pembekuan sperma, dapat dilihat dari kemampuan sperma tetap hidup setelah proses pembekuan. Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa kombinasi krioprotektan Gliserol dan Etilen Glikol memberikan persentase hidup sperma yang lebih tinggi (68%) dibandingkan dengan gliserol (65,6%) dan Etilen Glikol (64,8%). 1 6 2 Prosiding Seminar Nasionat Sapi Potong - Patu, 24 November 2008
Kombinasi kerioprotektan dalam medium memberikan hasil yang terbaik, hal itu dikarenakan keberadaan kedua krioprotektan dalam medium saling melengkapi. Pada proses pembekuan sperma, terjadi proses penurunan suhu yang mengakibatkan terjadinya pengeluaran molekul air secara besar-besaran dari dalam set sperma, sehingga terjadi peningkatan konsentrasi elektrolit intraseluler dan menyebabkan terbentuknya kristal-kristal es, apabila hat ini terjadi terus menerus, sperma akan mengalami kerusakan dan kematian. Pada kondisi ini kehadiran krioprotektan sangat dibutuhkan, karena krioprotektan dapat mengurangi efek negatif dengan cara masuk ke set sperma untuk menyeimbangkan osmolaritas. Etilen Glikol dan Gliserol sebagai krioprotektan akan menggantikan air yang keluar dari dalam set saat pembekuan berlangsung, sehingga keseimbangan elektrolit intra dan ekstra seluler dapat terjaga (McGinnis, 1993). Disamping itu, krioprotektan juga dapat menurunkan titik beku larutan, sehingga memberikan kesempatan kepada set untuk mengeluarkan air dan memperpanjang aklimatisasi set terhadap perubahan suhu yang drastis dan memperkecil jumlah air yang membeku intraseluler Tabel 2 Rataan Persentase Hidup Sperma setelah pembekuan Motilitas Sperma Persentase sperma motil merupakan perbandingan sperma hidup yang bergerak kedepan dengan konsentrasi sperma total dalam semen (Evans dan Maxwell, 1987). Motilitas sperma merupakan salah satu tolok ukur yang menunjukkan kemampuan sperma untuk dapat mencapai tempat oosit. Gerakan sperma progresif ke depan disebabkan oleh kontraksi sembilan pasang fibril yang dikoordinasikan oleh sepasang fibril mikro yang ada di bagian tengah, dan akhirnya menghasilkan gerakan berpilin maju ke depan. Kerusakan yang ditimbulkan akibat proses pembekuan mengakibatkan sperma bergerak berputar atau bahkan bergerak mundur. Tabel 3 Penampungan Ke Persentase hidup sperma G E G+E 1 55 55 62 2 63 60 66 3 70 65 70 4 66 70 67 5 70 69 72 6 68 67 70 7 67 68 69 Rataan 65,6 64,8 68 Rataan Persentase Motilitias Sperma setelah proses pembekuan Penampungan Ke Sperma Motil G E G+E 1 38 42 45 2 46 45 49 3 45 40 47 4 49 48 50 5 48 43 49 6 45 46 45 7 43 45 45 Rataan 45,2 44,1 47,2 Berdasarkan data yang diperoleh dari hasil penelitian, menunjukkan bahwa motilitas sperma setelah pembekuan adalah 45,2 %, 41,2% dan 52% berturut turut untuk medium yang diberi Prosiding Seminar Nasional Sapi Potong - Palu, 24 November 2008 1 6 3
kroprotektan Gliserol, Etilen Glikol dan kombinasi Gliserol dan Etilen Glikol. Motilitas tertinggi dihasilkan dari medium dengan kombinasi krioprotektan Gliserol dan Etilen Glikol, berdasarkan dari hasil teresbut menunjukkan bahwa kedua macam krioprotektan tersebut saling menunjang dan melengkapi dalam mengadakan perlindungan terhadap sperma. Etilen Glikol yang memiliki BM molekul lebih kecil dibandingkan dengan Gliserol, mempunyai kemampuan masuk dan keluar membran sel lebih cepat, akan tetapi mempunyai toksisitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan Gliserol. Motilitas sperma sangat dipengaruhi oleh ketersediaan suplai energi dalam sperma yang dihasilkan dari metabolisme berupa ATP. Metabolisme dapat berlangsung dengan baik apabila membran sperma dalam keaadaan utuh (Hafez 2000). Krioprotektan yang ditambahkan dalam medium pengencer, dapat berdifusi ke dalam sel dan dapat dimetabolisme dalam proses-proses yang menghasilkan energi dan membentuk fruktosa. Krioprotektan akan memasuki siklus perombakan fruktosa pada perombakan triosa fosfatdan selanjutnya akan dirombak menjadi laktat untuk dioksidasi lebih_lanjut. Fruktosa yang tersedia akan menyebabkan sperma tetap bergerak karena fruktosa berperan menghasilkan energi berupa ATP yang mengandung fosfat anorganik kaya energi dan akan digunakan untuk kontraksi fibril-fibril serta menghasilkan gerak sperma (Tambing et a!, 2001). Persentase Membran Plasma Utuh setelah thawing Daya hidup dan motilitas sperma sangat ditentukan oleh keutuhan membran plasma. Proses pembekuan semen dan proses thawing mengakibatkan kerusakan membran, hal ini disebabkan oleh penurunan dan peningkatan suhu semen yang drastis sehingga terjadi perubahan metabolisme yang sangat cepat. Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa persentase membran plasma utuh pada semen yang diberi kombinasi gliserol dan etilen glikol lebih tinggi MPU dibandingkan dengan semen yang diberi gliserol atau etilen glokol. Tabel 4 Rataan Membran Plasma Untuh (MPU) sperma setelah thawing Penampungan Ke Membran Plasma Utuh G E G+E 1 40 44 47 2 47 46 50 3 49 42 49 4 50 40 51 5 50 45 49 6 47 47 48 7 48 48 47 Rataan 47,3 44,6 48,7 Penambahan krioprotektan dalam medium pengencer dapat memberikan pengaruh positif terhadap integritas sel. Pada saat pembekuan dan thawing terjadi tekanan yang berat terhadap spermatozoa akibat penurunan suhu yang drastis saat pembekuan dan peningkatan suhu yang juga drastis saat thawing. Pada saat demikian penambahan kriprotektan baik gliserol mapun etilen glikol mampu memberikan perlindungan yang optimum terhadap keutuhan membran dan integritas sel. Dengan baiknya membran plasma, maka proses metabolisme akan berjalan dengan baik, sehingga akan mempertahankan motilitas dan daya hidup spermatozoa. 1 64 Prosiding Seminar Nasional Sapi Potong - Palu, 24 November 2008
Krioprotektan intraseluler (gliserol dan etilen glikol) dapat dengan mudah memasuki sel melewati membran sel melalui cara difusi bebas untuk menggantikan posisi molekul air yang keluar (sebagian volume air memang harus dikeluarkan supaya tidak terjadi kristal es intraseluler) saat pembekuan sehingga tidak terjadi efek solusi. Gliserol dan etilen glikol mampu mengikat molekul air karena mempunyai gugus hidroksil, sehingga air tidak keluar semua. Apibila sel kehilangan lebih dari 65 % molekul air, maka sel akan mengalami proses kekringan dan mengakibatkan kematian sel. Kehadiran krioprotektan yang mampu mengikat air, secara langsung juga mencegah molekul air membeku intraseluler menyatu untuk membentuk kristal es yang besar dan memiliki daya rusak yang besar terhadap sel. Gliserol dan etilen glikol yang membeku mempunyai permukaan yang halus sehingga tidak merusak membran sel, sehingga keutuhan membran plasma tetap terjaga (Supriatna dan Pasaribu, 1992). Kesimpulan Berdasarkan basil penelitian ini dapat disimpulkan sebagai berikut 1. Krioprotektan Gliserol dan Etilen Glikol dapat ditambahkan dalam medium pengencer untuk melindungi sperma dalam proses pembekuan. 2. Kombinasi Gliserol dan Etilen Gliko (2,5% dan 2,5%) memberikan perlindungan yang lebih baik terhadap kualitas sperma setelah proses pembekuan Daftar Pustaka Boediono, A., 1995. Apilkasi bioteknologi reproduksi pada hewan ternak dalam rangka peningkatan produksi dan kualitas. Jepang Inovasi. Volume 6. Evans G and W.M.C. Maxwell., 1987. Salamon's artificial insemination of sheep and goats. Butterworths. London. Hafez E.S.E., 2000. X and Y chromosome bearing spermatozoa. In Reproduction in farm animal. Lea and Febiger. Philadelphia. Kumar S, SahniKl., Mohan G., 1992. Effect of different levels of glycerol and egg yolk or freezing and stored of buffalo semen in milk, tris and sodium citrate buffers. B uffalo J. 2 : 151-156. Leibo SP., 1992. A one step methods for direct non surgical transfer of frozen thawed bovine embryos. Theriogenology. 21 : 767-787. Mazur P., 1980. Fundamental aspect of freezing of cell, with emphasis on mammalian ova and embryos. Proceeding 9`h International Congress of animals reproduction and Aḷ 1 : 99-114. McGinnis, L.K., S.C. Duplantis and Y.R. Youngs, 1993. Cryopreservation of sheep embryos using ethylene glycol. Elsevier Science Publishers. Amsterdam. Rizal M., M.R. Toelihere, T.L. Yusuf., B. Purwantara dan P Situmorang, 2002. Kualitas semen beku domba garutdalam berbagai konsentrasi gliserol. JITV 7 : 194-199. Rusiyantono Y., 2004. Toxicity and viability of goat embryos in freezing process using vitrification methods. J. Agroland Supriatna I dan F.H. Pasaribu, 1992. In vitro fertilisasi, Transfer embrio dan Pembekuan Embrio. PAU. IPB. Bogor. Seidel, G.E., 1990. Principles of cryopreservation of cells. Short course Proc. Colorado Tambing SN, Toelihere MR., Yusuf TL. Sutama IK., 2001. Kualitas semen beku kambing peranakan ettawah setelah ekuilibrasi. Hayati. : 70-75. Prosiding Seminar Nasional Sapi Potong - Palu, 24 November 2008 1 6 5