III. BAHAN DAN METODE

III. BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu Pelaksanaan Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei sampai September 2009. Penelitian dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan dan Laboratorium Lapangan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Metode Penelitian Metode penelitian meliputi persiapan wadah dan ikan uji, pembuatan ekstrak rumput laut Gracilaria verrucosa, penyediaan suspensi bakteri Aeromonas hydrophila, Uji LD 50, dan pengamatan parameter penelitian. 3.2.1 Persiapan Wadah dan Ikan Uji Tahap penelitian diawali dengan persiapan wadah. Pertama, akuarium dengan ukuran 60x30x30 cm 3 sebanyak 20 buah yang telah disiapkan dibilas dengan air untuk menghilangkan kotoran yang menempel. Kedua, akuarium diisi dengan air sampai penuh dan ditambahkan kaporit sebanyak 30 gram untuk desinfeksi wadah. Akuarium direndam selama 24 jam, setelah 24 jam air kaporit dibuang dan akuarium dibilas dengan menggunakan air bersih. Selanjutnya dilakukan proses pengeringan wadah, akuarium diletakkan dengan posisi terbalik dalam waktu semalam agar semua air dapat menguap. Setelah akuarium kering, dilakukan pengisian air dari air tandon yang telah diendapkan sampai volume setengah akuarium. Persiapan terakhir adalah pengecekan sistem aerasi, agar oksigen terdistribusi dengan baik. Persiapan ikan uji diawali dengan sortir ikan yang akan digunakan pada awal kedatangan ikan. Setelah diperoleh ukuran ikan yang seragam dengan berat rata-rata 30 ± 5,59 gram, ikan diadaptasikan di sebuah tandon selama 1 minggu. Ikan lele yang akan dimasukkan ke dalam tandon sebelumnya direndam dengan larutan garam 30 ppm selama 5 menit. Setelah 1 minggu, ikan dimasukkan ke dalam akuarium perlakuan dengan kepadatan 5 ekor/akuarium. Dalam akuarium perlakuan, ikan diadaptasikan kembali pada kondisi dan ruang gerak yang lebih sempit dalam waktu 1 minggu. Selama proses pengadaptasian, ikan diberikan pakan komersil dengan F 3% dengan frekuensi pemberian pakan sebanyak 3 kali 15

sehari. Untuk menjaga kualitas air dilakukan penyiponan sebanyak 50% setiap 2 kali sehari. 3.2.2 Pembuatan Ekstrak Gracilaria verrucosa Pembuatan ekstrak G. verrucosa diawali dengan pengambilan rumput laut di Tambak Inti akyat (TI), Karawang. Selanjutnya, rumput laut dicuci dengan menggunakan air tawar sampai bersih dan biofouling hilang. Setelah bersih, rumput laut dikeringkan udara terbuka selama 3 hari. Setelah rumput laut kering, dilakukan penimbangan sebanyak 500 gram. Lalu rumput laut dihaluskan dengan menggunakan penggilingan kemudian diayak dengan ayakan ukuran 60 mesh size. Setelah mendapatkan bubuk rumput laut, bubuk dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan etanol dengan perbandingan 1 : 5. Etanol berfungsi sebagai pelarut. Lalu, rumput laut dishaker selama 12 jam. umput laut yang telah diendapkan ini disaring dengan menggunakan vacuum pump hingga diperoleh 1,5 liter larutan yang akan di evaporasi. Setelah disaring, larutan ini diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 50 C. Setelah diuapkan, diperoleh 36 gram maserat. Kemudian maserat dikeringkan dengan menggunakan freeze dryer selama 48 jam hingga menjadi tepung ekstrak. Dari proses ini, 500 gram rumput laut dapat menjadi 21,619 gram tepung ekstrak. 3.2.3 Penyediaan Suspensi Bakteri Aeromonas hydrophila Biakan bakteri yang ditanam dalam media Tripticase Soy Agar (TSA) selama 24 jam diambil dengan menggunakan jarum ose sebanyak satu bulatan penuh. Kemudian bakteri dikultur dalam media Tripticase Soy Broth (TSB) dan diinkubasi dalam waterbath shaker dengan suhu 28 C selama 24 jam. Selanjutnya, dilakukan pencucian bakteri dengan cara mengambil 1 ml bakteri dan dimasukkan ke dalam eppendorf. Kemudian bakteri disentrifuse hingga diperoleh endapan dan cairan. Cairan dibuang dan ditambahkan PBS untuk pencucian kembali. Proses pencucian ini diulangi sebanyak 2 kali pencucian. Setelah pencucian bakteri, A. hydrophila diambil dengan melakukan metode pengenceran sesuai dengan kepadatan yang diinginkan. 16

3.2.4 Uji LD 50 Uji LD 50 dilakukan dengan mempersiapkan ikan uji yang akan digunakan. Ikan lele dimasukkan dalam akuarium dengan kepadatan 10 ekor/akuarium. Ikan diadaptasikan selama 3 hari. Selanjutnya, ikan disuntikan dengan dengan isolat A.hydrophila dengan konsentrasi 10 5, 10 6, 10 7, 10 8, 10 9 cfu/ml sebanyak 0,2 ml/ekor. Penyuntikan dilakukan melalui intramuscular. Pengamatan LD 50 dilakukan selama 7 hari dengan 2 kali pengulangan. Selama pengamatan, diamati tingkat kematian ikan sampai diperoleh berapa konsentrasi bakteri yang dapat mematikan 50% ikan dalam akuarium perlakuan selama 7 hari. Dari pengamatan yang telah dilakukan tingkat kematian 50% selama 7 hari disebabkan oleh bakteri A.hydrophila dengan kepadatan 10 8 cfu/ml. 3.2.5 Uji In Vivo Penelitian yang dilakukan dibagi ke dalam 5 perlakuan dan 3 ulangan, yaitu: 1. Perlakuan A, tanpa penambahan ekstrak G.verrucosa (0 g/kg pakan). 2. Perlakuan B, pakan dengan penambahan ekstrak G.verrucosa sebanyak 0,5 g/kg pakan. 3. Perlakuan C, pakan dengan penambahan ekstrak G.verrucosa sebanyak 1,0 g/kg pakan. 4. Perlakuan D, pakan dengan penambahan ekstrak G.verrucosa sebanyak 1,5 g/kg pakan. 5. Perlakuan E, pakan dengan penambahan ekstrak G.verrucosa sebanyak 2,0 g/kg pakan. Penelitian utama yang dilakukan berupa pencegahan serangan Aeromonas hydrophila dengan penambahan ekstrak G.verrucosa ke dalam pakan. Ikan lele diadaptasikan dalam akuarium perlakuan selama 7 hari. Selama proses adaptasi, ikan diberi pakan komersil dengan F 3% sebanyak 3 kali/hari. Setelah 7 hari, masuk ke penelitian utama. Ikan lele diberikan pakan perlakuan selama 21 hari dengan F 3%, frekuensi pemberian pakan sebanyak 3 kali/hari, yaitu pada jam 08.00 WIB, 12.00 WIB dan 17.00 WIB. Setelah pemeliharaan selama 21 hari, dilakukan uji tantang dengan bakteri A. hydrophila yang disuntikan dengan konsentrasi 10 8 cfu/ml melalui intramuskular sebanyak 0,2 ml/ekor. Pengamatan 17

uji tantang ini dilakukan selama 7 hari dengan mengamati diameter gejala klinis, pengamatan organ dalam dan tingkat kelangsungan hidup dari ikan yang telah disuntikan A.hydrophila. Selama pemeliharaan 21 hari, dilakukan kegiatan sampling seperti pengamatan respon makan, pertambahan bobot tubuh dan dilakukan pengamatan parameter gambaran darah yang meliputi perhitungan total eritrosit, total leukosit, pengukuran kadar hemoglobin dan hematokrit, pembuatan preparat indeks fagositik dan diferensial leukosit. Kegiatan sampling dilakukan setiap 1 minggu sekali (H0, H7, H14, H21) selama 21 hari. Untuk pengukuran kualitas air, parameter suhu diukur setiap hari pagi, siang dan sore. Sedangkan untuk ph, DO, dan TAN dilakukan pada awal perlakuan, pertengahan perlakuan, dan akhir perlakuan. Berikut ini merupakan bagan uji in vivo: Sampling Pakan Perlakuan Uji Tantang hari 3.2.6 Parameter yang Diamati Parameter yang diamati pada penelitian ini adalah respon makan, pertambahan bobot tubuh, parameter hematologi, pengamatan gejala klinis, pengamatan organ dalam, tingkat kelangsungan hidup dan kualitas air. 3.2.6.1 espon Makan Parameter respon makan diamati setiap hari dengan frekuensi 3 kali, yaitu: pagi, siang dan sore. espon makan diamati dengan pemberian skor sebagai berikut: 0 = tidak nafsu makan (pakan tidak termakan sama sekali atau pakan utuh) 1 = respon makan sedikit (sisa pakan ¾ bagian) 2 = respon makan sedang (sisa pakan ½ bagian) 3 = respon makan tinggi (sisa pakan ¼ bagian) 4 = respon makan sangat tinggi (tidak ada sisa pakan, pakan habis) 18

3.2.6.2 Pertambahan Bobot Tubuh Parameter bobot diukur dengan menggunakan timbangan digital. Pengukuran dilakukan setiap sampling, yaitu pada H0, H7, H14 dan H21. Data yang diperoleh dihitung dengan menggunakan rumus Specific Growth ate (SG). umus SG: SG = t Wt Wo 1 100% Keterangan: t Wt W0 = waktu (hari) = bobot rata-rata individu pada hari ke-t (gram/ekor) = bobot rata-rata individu pada hari ke-0 (gram/ekor) SG = pertumbuhan spesifik atau laju pertumbuhan harian individu (%) 3.2.6.3 Parameter Hematologi a) Perhitungan Total Sel Darah Merah (SDM) Perhitungan total sel darah merah dihitung dengan menggunakan haemocytometer. Pertama, darah dihisap dengan pipet sampai skala 0,5. Selanjutnya, ditambahkan larutan Hayem sampai skala 101. Pipet digoyangkan membentuk angka 8 selama 3 5 menit. Tetesan pertama pada pipet dibuang, lalu tetesan selanjutnya diteteskan dalam haemocytometer. Selanjutnya, dilakukan perhitungan pada 10 kotak kecil dengan perbesaran 400 kali. Keterangan: = kotak besar untuk menghitung eritrosit (sel darah merah) Sel darah merah dihitung pada 10 kotak besar () haemocytometer total SDM = 1 + 2 + + 10 umus Total SDM: SDM = Jumla sel teritung = 1+ 2 + + 9 + 10 10 1 volume kotak kecil 1 0,2 0,2 0,1 mm 3 200 faktor pengenceran = sel mm 3 19

b) Perhitungan Total Sel Darah Putih (SDP) Perhitungan total sel darah putih dihitung dengan menggunakan haemocytometer. Pertama, darah dihisap dengan pipet sampai skala 0,5. Selanjutnya, ditambahkan larutan Turk s sampai skala 11. Pipet digoyangkan membentuk angka 8 selama 3 5 menit. Tetesan pertama pada pipet dibuang, lalu tetesan selanjutnya diteteskan dalam haemocytometer. Selanjutnya, dilakukan perhitungan pada 16 kotak besar dengan perbesaran 400 kali. W W W W Keterangan: W = kotak besar untuk menghitung leukosit (sel darah putih) Sel darah merah dihitung pada 4 kotak besar (W) haemocytometer W total SDP = W 1 +W 2 +W 3 +W 4 umus Total SDP: SDP = Jumla sel teritung 1 volume kotak besar faktor pengenceran = W 1+ W 2 + W 3 + W 4 4 = sel mm 3 50 22 c) Pengukuran Kadar Hemoglobin (Wedemeyer dan Yasutake, 1977 dalam Alifuddin, 1999) Pengukuran kadar hemoglobin dilakukan dengan metode Sahli. HCL 0,1 N dimasukkan ke dalam tabung hemometer sampai skala 10 (skala merah). Selanjutnya dengan menggunakan pipet sahli, dimasukkan darah dengan skala 5. Setelah itu, ke dalam tabung ditambahkan akuades sampai warna dalam larutan dalam tabung sama dengan warna kedua sisi tabung hemometer. Lalu skala kuning dibaca untuk menentukan kadar hemoglobin. d) Pergukuran Kadar Hematokrit (Anderson dan Siwicki, 1993) Pengukuran kadar hematokrit dilakukan dengan cara darah dihisap dengan menggunakan tabung hematokrit sampai volume ¾ bagian. Selanjutnya, darah disentrifuse selama 5 menit dengan kecepatan 8000 rpm. Lalu dilakukan 20

pengukuran volume padatan dan volume total darah dengan menggunakan penggaris. umus Kadar Hematokrit: Kadar Hematokrit = volume sel dara mera volume total dara 100% e) Pembuatan Preparat Diferensial Leukosit (Amlacher, 1970) Langkah pertama membuat preparat diferensial leukosit, yaitu darah diambil sebanyak 5 µl dan diteteskan ke gelas obyek. Lalu dibuat ulasan dengan menggunakan gelas obyek yang dimiringkan dengan sudut 45º. Setelah itu ulasan dikeringkan. Setelah kering, ulasan difiksasi dengan menggunakan metanol selama 5 menit dan dikeringkan udara. Langkah selanjutnya, ulasan direndam dalam larutan Giemsa selama 15 menit dan dikeringkan. Langkah terakhir, ulasan dicuci dengan menggunakan air mengalir dan dikeringkan. Preparat telah siap diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali untuk mengetahui persentase nilai monosit, limfosit, trombosit dan neutrofil. f) Pembuatan Preparat Indeks Fagositik (Anderson dan Siwicki, 1993) Pambuatan preparat indeks fagositik dilakukan dengan cara pertama darah dipipet sebanyak 50 µl dan ditambahkan bakteri Staphylococcus aureus dengan konsentrasi 10 8 cfu/ml, dimasukkan ke dalam eppendorf. Darah dan bakteri dihomogenkan dan diinkubasi selama 20 menit. Kedua, dari campuran darah dan bakteri yang telah diinkubasi diambil 5 µl untuk dibuat ulasan pada gelas obyek dan dikeringkan udara. Ketiga, ulasan difiksasi dengan larutan metanol selama 5 menit dan dikeringkan. Setelah kering, ulasan direndam di larutan Giemsa selama 15 menit dan dikeringkan. Lalu, ulasan dicuci dengan air mengalir setelah itu dikeringkan udara. Setelah kering, preparat diamati di bawah mikroskop dengan menghitung jumlah sel yang terfagosit. 21

3.2.6.4 Gejala Klinis dan Pengukuran Diameter Gejala Klinis (Sophiana, 2005) Pengukuran gejala klinis diamati selama 7 hari pada saat uji tantang dengan bakteri A.hydrophila. Setiap hari, ikan yang telah disuntikan bakteri A.hydrophila diukur diameter lukanya dengan menggunakan penggaris dan dilakukan pencatatan. Pemberian skor gejala klinis sebagai berikut: SN = Ikan sembuh, skor 0 N = Ikan normal, skor 0 = Ikan radang, skor 1 H = Ikan hemoragi, skor 2 T = Ikan tukak, skor 3 M = Ikan mati, skor 4 Diameter Klinis di bagi menjadi 4, yaitu: - Diameter klinis berada di antara (0,1-1,4 cm) diberi angka 1 - Diameter klinis berada di antara (1,5-2,4 cm) diberi angka 2 - Diameter klinis berada di antara (2,5-3,4 cm) diberi angka 3 - Diameter klinis berada di antara (3,6-4,5 cm) diberi angka 4 Misal, bila diameter gejala klinis berupa hemoragi berada diantara (1,5-2,4 cm) diberi angka 2, maka skornya : 2x2=4 demikian seterusnya. 3.2.6.5 Pemeriksaan Organ Internal Ikan Pemeriksaan organ dalam ikan dilakukan dengan membedah tubuh ikan pada akhir penelitian masing-masing 1 ekor dari setiap perlakuan. Ikan uji dibedah dan diamati perubahan yang terjadi pada organ internal ikan uji. 3.2.6.6 Tingkat Kelangsungan Hidup (S) Tingkat kelangsungan hidup (S) diamati saat dilakukan uji tantang dengan bakteri A.hydrophila setelah 21 hari pemberian pakan perlakuan. Pengamatan tingkat kelangsungan hidup dilakukan selama 7 hari dengan mencatat jumlah ikan lele yang mati pada setiap perlakuan dan ulangan. 22

umus S: S = N t N 0 100% Keterangan: N t = Jumlah ikan hidup pada akhir pemeliharaan N 0 = Jumlah ikan hidup pada awal pemeliharaan 3.2.6.7 Kualitas Air Kualitas air diukur 3 kali selama penelitian, yaitu pada awal, pertengahan dan akhir penelitian. Parameter kualitas air yang diukur adalah DO (mg/l), suhu ( C), ph dan TAN. Untuk menjaga kondisi kualitas air selama penelitian setiap 2 hari sekali dilakukan penyiponan sebanyak 50%. 3.2.7 Analisa Data Data hasil pengamatan meliputi respon makan, pertambahan bobot, parameter hematologi (total eritrosit, total leukosit, kadar hemoglobin, kadar hematokrit, diferensial leukosit dan indeks fagositik), pengamatan gejala klinis, pengamatan organ dalam, tingkat kelangsungan hidup dan kualitas air. Penelitian ini menggunakan ancangan Acak Lengkap (AL) yang tediri dari 5 perlakuan (Pakan A, Pakan B, Pakan C, Pakan D, Pakan E) dengan masingmasing 3 kali ulangan. Data parameter hematologi diuji dengan Microsoft Office Excel 2007 dan jika berbeda nyata dilanjutkan dengan uji lanjutan menggunakan SPSS 16 metode Duncan s. Sedangkan data hasil pengamatan respon makan, pertambahan bobot, gejala klinis, pengamatan organ dalam, tingkat kelangsungan hidup dan data kualitas air dianalisis secara deskriptif. 23