15 III BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1 Bahan Penelitian 3.1.1 Objek Penelitian Objek pada penelitian ini adalah semen yang didapat dari kambing pejantan Peranakan Etawah berumur 1,5-3 tahun dan dipelihara di Breeding Station Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran berjumlah 5 ekor. Pakan yang diberikan yaitu berupa hijauan sebanyak 5-6 kg/ekor/hari serta diberi tambahan konsentrat sebanyak 700-800 gram/ekor/hari. 3.1.2 Alat Penelitian: 1) Alat penampungan semen 1. Satu set vagina buatan untuk menampung semen kambing 2. Thermometer untuk mengukur suhu air hangat yang akan digunakan 3. Termos untuk menyimpan air hangat 2) Alat evaluasi semen 1. Mikroskop untuk mengamati semen secara mikroskopis 2. Objek glass sebagai wadah untuk menyimpan semen dalam pengamatan mikroskopis 3. Cover glass untuk menutup media yang terdapat di objek glass 4. Pipet untuk mengambil semen 5. Kertas lakmus untuk mengukur ph semen 6. Batang pengaduk untuk mencampurkan media semen dengan zat lain 7. Tabung reaksi sebagai wadah untuk menyinpan semen 8. Pipet Erythrocyte untuk pengamatan konsentrasi total
16 9. Haemocytometer batu merah untuk pengamatan konsentrasi total 10. Kamar hitung Neubauer untuk pengamatan konsentrasi total 11. Rak tabung reaksi untuk menyimpan tabung reaksi 3) Alat pengencer semen 1. Timbangan analitik untuk menimbang bahan pengencer 2. Kertas saring untuk menyaring bahan yang akan digunakan 3. Tabung Erlenmeyer untuk menyimpan larutan pengencer yang akan digunakan 4. Gelas ukur untuk mengukur banyaknya larutan pengencer 5. Alumunium foil atau parafin film untuk menutup tabung erlenmeyer 4) Alat pembekuan semen 1. Straw volume 0,25 ml sebagai tempat untuk semen saat dibekukan 2. Canister sebagai tempat menyimpan straw didalam container 3. Goblet sebagai tempat menyimpan straw didalam container 4. Container sebagai tempat yang berisi nitrogen (N 2 ) cair 5. Kotak styrofoam sebagai wadah yang digunakan pada saat pembekuan semen. 3.1.3 Bahan Penelitian 1. Penampungan Semen 1. Air hangat dengan suhu 38-45 0 C dimasukkan ke dalam vagina buatan 2. Vaseline untuk melicinkan vagina buatan 2. Evaluasi Semen Secara Mikroskopis 1. Larutan NaCl 3% untuk pengamatan konsentrasi spermatozoa 2. Eosin 2% untuk pengamatan abnormalitas spermatozoa 3. Pengencer Semen
17 1. Sitrat sebagai bahan pengencer 2. Kuning telur sebagai anti cold shock bagi spermatozoa 3. Fruktosa untuk memenuhi nutrisi bagi spermatozoa 4. Gliserol sebagai agen krioprotektan 5. Penicillin dan streptomycin sebagai bahan antibiotika dalam proses pengenceran semen 6. Aqubidestilata untuk melarutkan bahan pengencer 4. Pembekuan Semen dan Thawing Semen a. Nitrogen cair dengan suhu -196 0 C untuk proses pembekuan semen b. Air hangat dengan suhu 37-38 0 C untuk mencairkan kembali semen yang telah dibekukan 3.1.4 Prosedur Penelitian A. Penampungan Semen - Mengisi vagina buatan (VB) dengan air hangat bersuhu 38 45 0 C dan diberi vaseline pada bagian selongsong - Pejantan didekatkan dengan ternak pemancing untuk merangsang pejantan yang akan ditampung lalu dilakukan 2 3 kali false mount - Pejantan menaiki pemancing dan semen ditampung dengan mengarahkan penis ke mulut VB yang telah disiapkan - Setelah penis masuk kedalam vagina buatan akan terjadi sentakan keras dan pejantan mengalami ejakulasi lalu mengeluarkan semen - Semen akan tertampung ke dalam tabung gelas penampung semen - Tabung gelas kemudian dilepaskan dari corong karet dan bagian yang terbuka ditutup dengan aluminium foil atau plastik - Semen dibawa ke laboratorium untuk segera di evaluasi.
18 B. Evaluasi Semen Evaluasi semen dilakukan secara makroskopis dan mikroskopis yang bertujuan untuk mengetahui kualitas semen yang dihasilkan sebagai uji layak atau tidaknya untuk dilakukan pembekuan semen. 1. Evaluasi Semen Segar Secara Makroskopis a. Volume semen Volume semen dapat diketahui secara langsung dengan melihat angka pada tabung berskala. b. Warna semen Warna semen bervariasi antara kuning, krem, ataupun menyerupai warna susu. Warna semen dapat diketahui dengan melihat semen pada gelas penampung. Warna yang tidak normal dapat disebabkan akibat semen terkontaminasi dengan adanya kotoran, darah, ataupun feses. c. Derajat keasaman (ph) Derajat keasaman (ph) pada semen kambing dapat diketahui dengan menggunakan kertas lakmus atau kertas indikator ph. d. Bau semen segar Semen segar mempunyai bau yang khas. Bau semen dapat diketahui dengan dengan mencium bau semen dari ujung tabung. Bau yang tidak wajar atau busuk dapat disebabkan spermatozoa pada semen telah banyak yang mati karena ternak terserang penyakit. e. Konsistensi atau kekentalan Konsistensi atau kekentalan dapat diketahui dengan cara menggoyangkan tabung berisi sperma secara perlahan-lahan. Semen yang baik mempunyai konsistensi yang kental
19 2. Evaluasi Semen Segar Secara Mikroskopis a. Gerakan Massa Gerakan massa dapat dievaluasi dengan adanya kecenderungan spermatozoa bergerak bersama-sama ke satu arah dan membentuk gelombang yang tebal dan tipis. Gerakan massa dapat dilihat dengan meneteskan semen ke objek glass dan melakukan pengamatan dibawah mikroskop dengan perbesaran 10x10. Gerakan massa bernilai (+++) apabila semen yang diamati gerakannya cepat berpindah dan berbentuk gumpalan tebal dan gelap. Gerakan massabernilai (++) apabila semen yang diamati gerakannya cepat berpindah dan berbentuk gumpalan terang. Apabila hanya terlihat gerakan sperma sendiri dan tidak ada gumpalan, maka nilai gerakan massanya adalah (+). b. Konsentrasi Total Perhitungan konsentrasi sperma total dilakukan dengan menggunakan hitung Neubauer dengan cara mengisap semen sampai tanda 0,5 menggunakan pipet Erythrocyt. Kemudian NaCl 3% dihisap sampai tanda 1,01 lalu dihomogenkan dengan hati-hati selama 2-3 menit dengan membentuk angka delapan. Buang beberapa tetesan pertama lalu teteskan pada celah kamar hitung Neubauer dan ditutup dengan cover glass. Lakukan pengamatan dibawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 40. Hitung jumlah sel spermatozoa dalam 5 kamar dihitung menurut arah diagonal. Dalam 5 kamar hitung terdapat 16 ruangan kecil dengan volume setiap ruangan kecil 0,1mm 3 dan pengenceran 200 kali. c. Motilitas Spermatozoa Motilitas spermatozoa adalah kemampuan spermatozoa untuk melakukan gerak maju atau progresif. Motilitas juga merupakan daya gerak spermatozoa
20 yang dinilai segera setelah penampungan semen. Pengamatan motilitas spermatozoa bertujuan untuk melihat pergerakan sperma. C. Pengenceran Semen yang telah dievaluasi secara makroskopis dan mikroskopis, selanjutnya akan dilakukan pengenceran semen. 1. Perhitungan jumlah dosis pengencer Dosis = Volume semen x Konsentrasi total x Motilitas sperma 2x Konsentrasi spermatozoa motil dalam satu dosis IB x 100% 2. Perhitungan volume pengencer dan semen : Volume pengencer + semen = Jumlah dosis x Volume inseminasi 3. Perhitungan volume pengencer yang ditambahkan: Pengencer = ( Volume pengencer + semen) ( Volume semen) D. Pembuatan Bahan Pengencer Sitrat-kuning telur - Menimbang Natrium sitrat sebanyak 2,9 gram dan 0,5 gram Fruktosa. - Ditambahkan aqubidestilata hingga mencapai volume 100 ml dan dikocok hingga homogen, lalu menghitung ph dari larutan tersebut. - Larutan tersebut dipindahkan ke dalam labu erlenmeyer dan mulut labu ditutup dengan aluminium foil atau parafin film. - Kuning telur dipisahkan terlebih dahulu dari selaput viteline - Menyiapkan 80 ml larutan buffer (Natrium sitrat fruktosa) dalam beaker glass 100 ml. - Sebanyak 20 ml kuning telur ditambahkan ke dalam beaker glass berisi natrium sitrat tersebut.
21 - Diaduk hingga merata dengan mengunakan batang pengaduk. - Lakukan pengadukan dengan hati-hati agar tidak terbentuk busa yang berlebihan. - Ditambahkan 100.000 internasional unit (IU) Penicillin dan 100 mg Streptomycin ke dalam larutan Natrium sitrat Kuning Telur (1000 IU Penicillin dan 1 mg Streptomycin untuk setiap milliliter pengencer) - ph dihitung dan tutup mulut beaker glass dengan aluminium foil atau parafin film. E. Penambahan Gliserol Penambahan gliserol dalam semen yang telah diberi pengencer berfungsi sebagai krioprotektan untuk mengatasi cold shock pada semen kambing. Penambahan gliserol dibagi atas 5 perlakuan. - Menyiapkan 10 tabung yang dibagi pada dua rak tabung, dan pada rak pertama dimasukkan pengencer sitrat kuning telur saja. - Pada rak kedua dimasukkan pengencer sitrat kuning telur yang sebelumnya telah dihitung kebutuhan gliserol. Penambahan gliserol dilakukan dengan cara mengeluarkan sejumlah pengencer sesuai dengan jumlah gliserol yang akan dimasukkan. - Semen lalu dimasukkan secara perlahan kedalam tabung yang berisi pengencer sitrat kuning telur saja dan diaduk secara perlahan hingga homogen. - Pengencer yang telah ditambahkan gliserol lalu dimasukkan kedalam tabung yang berisi pengencer dan semen secara perlahan. - Lakukan secara perlahan-lahan pada suhu kamar. - Selanjutnya diaduk secara perlahan hingga homogen.
22 F. Pengemasan Straw Pengemasan semen ke dalam straw dilakukan di dalam lemari es agar temperaturnya tetap pada 5 0 C. Kemasan straw yang digunakan adalah straw dengan volume tiap straw sebesar 0,25 ml. Pengemasan staw dilakukan dengan cara : - Sambungkan ujung straw yang memiliki sumbat kapas dengan selang penghisap. - Ujung straw yang lain disambungkan dengan pompa penghisap. - Tuangkan semen dari beaker glass ke dalam cawan plastik khusus untuk pengisian straw. - Hidupkan pompa penghisap dan biarkan cairan semen memasuki straw hingga penuh. - Setelah straw terisi penuh tutup ujung bebas straw dengan tepung polyvinyl alcohol. - Simpan straw kedalam lemari es dengan temperatur 5 0 C selama 2-4 jam untuk proses equilibrasi. G. Equilibrasi dan Pembekuan Semen Equlibrasi yaitu proses yang dibutuhkan spermatozoa sebelum pembekuan agar beradaptasi dengan pengencer dan suhu rendah. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Tuli, dkk. (1981) dan Herdis, dkk. (1999) yang mendapatkan waktu equilibrasi 4 jam menghasilkan motilitas spermatozoa terbaik dibandingkan dengan waktu 2 dan 6 jam. Selanjutnya proses pre freezing dilakukan diatas Nitrogen cair dalam storage container dengan suhu -80 hingga -100 0 C dibiarkan menguapi straw yang berjarak 3-5 cm dari pemukaan cairan selama kurang lebih 7-8 menit. Proses freezing dilakukan dengan cara memasukkan straw ke dalam
23 nitrogen cair bersuhu -196 0 C. Straw yang telah membeku dimasukkan ke dalam goblet ditempatkan di dalam canister. H. Thawing ( Pencairan kembali ) Thawing semen yang telah dibekukan dilakukan dengan cara memasukkan semen ke dalam air yang bersuhu 37-38 0 C selama kurang lebih 35 detik. Semen yang telah di thawing, dilakukan evaluasi post thawing untuk mengetahui motilitas dan abnormalitas. I. Prosedur pengamatan Motilitas Post Thawing Motilitas spermatozoa adalah kemampuan spermatozoa untuk melakukan gerak maju atau progresif. Motilitas juga dapat dipengaruhi oleh spesies ternak, kondisi dan temperatur lingkungan (Toelihere, 1993). Standar kualitas semen beku yang baik digunakan untuk IB dimana untuk motilitas sperma setelah thawing yaitu 40%. Pengamatan motilitas dilakukan dengan menggunakan uji Post Thawing Motility (PTM) (Fitrik dan Supartini, 2012). Prosedur yang dilakukan dalam pengamatan motilitas spernatozoa post thawing yaitu: 1. Semen yang telah di thawing dihisap menggunakan pipet Erythrocyt sampai tanda 0,5 2. Kemudian pengencer sitrat dihisap sampai tanda 1,01 3. Lalu dihomogenkan secara hati-hati dengan membentuk angka delapan selama 2-3 menit. 4. Beberapa tetesan pertama dibuang, lalu diteteskan pada celah kamar hitung Neubauer lalu ditutup dengan cover glass. 5. Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 40.
24 6. Menghitung jumlah sel spermatozoa yang mati dalam 5 kamar dihitung menurut arah diagonal. 7. Semen lalu didiamkan hingga seluruh spermatozoa mati sehingga dihitung konsentrasi total. 8. Selanjutnya dapat dihitung nilai motilitas spermatozoa post thawing J. Prosedur pengamatan Abnormalitas Spermatozoa Post Thawing Abnormalitas pada spermatozoa ikut memegang peranan penting terhadap kualitas spermatozoa karena dapat menentukan baik atau tidaknya sperma tersebut. Persentase abnormalitas spermatozoa ditentukan dengan pewarnaan diferensial menggunakan larutan eosin. Prosedur yang dilakukan dalam pengamatan abnormalitas spermatozoa post thawing yaitu: 1. Semen diteteskan diatas gelas objek. 2. Kemudian ditetesi dengan larutan warna eosin-negrosin. 3. Dilakukan pencampuran dan selanjutnya dibuat preparat ulas. 4. Selanjutnya preparat tersebut dikeringkan menggunakan bunsen. 5. Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop dengan pembesaran 10x40 atau 10x10. 6. Selanjutnya diamati sebanyak kurang lebih 200 sel spermatozoa. 3.2 Metode Penelitian 3.2.1 Peubah yang diamati A. Motilitas Spermatozoa Perhitungan motilitas pada spermatozoa dengan mengamati spermatozoa hidup dan spermatozoa mati. Spermatozoa yang tidak bergerak progesif dan diam ditempat dapat dikategorikan sebagai spermatozoa yang mati.
25 Perhitungan motilitas spermatozoa sebagai berikut : % Motilitas Sperma = Konsentrasi total - Sperma yang mati Konsentrasi total sperma x 100% B. Abnormalitas Spermatozoa Abnormalitas spermatozoa dapat dibedakan menjadi abnormalitas primer dan abnormalitas sekunder. Abnormalitas primer terjadi karena adanya kegagalan dalam proses spermatogenesis di tubuli seminiferus. Abnormalitas primer dapat dikarenakan faktor keturunan dan pengaruh lingkungan yang buruk. Bentuk dari abnormalitas primer meliputi kepala besar atau kepala kecil, kepala pendek, lebar, dan ekor ganda. Adapun abnormalitas sekunder terjadi setelah sel kelamin jantan meninggalkan tubuli seminiferi, karena pemanasan yang berlebihan, pendinginan yang terlalu cepat dan kontaminasi dengan air atau urine (Toelihere, 1993). Pengamatan abnormalitas spermatozoa yang diamati dalam penelitian ini adalah abnormalitas sekunder. Bentuk abnormalitas sekunder meliputi bagian ekor yang melipat dan selubung akrosom yang terlepas dari kepala tanpa adanya ekor, dan ekor yang terputus. Penentuan abnormalitas spermatozoa dengan membandingkan antara spermatozoa abnormal dengan spermatozoa normal pada sudut pandang yang sama (Fitrik dan Supartini, 2012). Perhitungan abnormalitas pada spermatozoa yaitu : Abnormalitas = Spermatozoa Abnormal Spermatozoa Normal + Spermatozoa Abnormal x 100%
26 3.2.2 Rancangan Percobaan dan Analisis Statistik Penelitian yang dilakukan menggunakan metode eksperimental dengan menggunakan RAK (Rancangan Acak Kelompok). Dilakukan 5 perlakuan dan 5 ulangan sehingga terdapat 25 unit percobaan. Kelompok dalam penelitian ini adalah penampungan semen dari lima ekor kambing dengan perlakuan sebagai berikut: 1. P1 = Semen + (Pengencer + gliserol 5%) 2. P2 = Semen + (Pengencer + gliserol 6%) 3. P3 = Semen + (Pengencer + gliserol 7%) 4. P4 = Semen + (Pengencer + gliserol 8%) 5. P5 = Semen + (Pengencer + gliserol 9%) Data diuji dengan analisis ragam dan dengan uji jarak berganda Duncan. Adapun model matematika dan rancangan yang digunakan, yaitu model matematik menurut Gazperz (1991) adalah sebagai berikut: Y ij = µ + α i + β j + ε ij Keterangan: Y ij : Respon hasil pengamatan dari perlakuan ke-i dan kelompok ke-j µ : Nilai tengah populasi α i : Pengaruh perlakuan ke-i β j : Pengaruh kelompok ke-j ε ij : Galat percobaan pada perlakuan ke-i kelompok ke-j Hipotesis yang akan diuji adalah : : Pengaruh perlakuan P 1 = P 2 = P 3 = P 4 = P 5, tidak ada perbedaan yang nyata terhadap motilitas dan abnormalitas : Pengaruh perlakuan P 1 P 2 P 3 P 4 P 5, atau paling sedikit ada satu perlakuan yang berbeda nyata terhadap motilitas dan abnormalitas.
27 Hasil analisis data penelitian yang didapat, akan disajikan dalam tabel sidik ragam berikut. Tabel 1. Daftar Sidik Ragam Sumber Keragaman db JK KT Fhit F 0,05 Kelompok (r-1) 4 JKK JKK/db Perlakuan (t-1) 4 JKP JKP/db KTP/KTG Galat ((r-1)(t-1)) 16 JKG JKG/db Total (tr-1) 24 JKT Keterangan: db = Derajat bebas JK = Jumlah kuadrat KT = Kuadrat tengah Kaidah keputusan: 1. Bila F hitung F 0,05 berbeda tidak nyata (non significant), maka terima H 0 dan tolak H 1. 2. Bila F hitung > F 0,05 berbeda nyata (significant), maka tolak H 0 dan terima H 1. Jika H 0 ditolak, maka selanjutnya untuk mengethui perbedaan antar perlakuan dilakukan analisis dengan menggunakan Uji Jarak Berganda Duncan, dengan rumus : LSR = SSR x S y S y = KTG R Keterangan : S y = Galat Baku KTG = Kuadrat Tengah Galat r = Ulangan Periode LSR = Least Significant Range (Jarak beda nyata terkecil) SSR = Studentized Significant Range
Bila selisih antara perlakuan dibanding dengan LSR, kaidah keputusan sebagai berikut: 1. Bila d < nilai LSR, maka non signifikan 2. Bila d nilai LSR, maka signifikan Keterangan : d = selisih antar perlakuan 28