Lampiran 1. Prosedur Analisis Karakteristik Pati Sagu 1. Analisis Kadar Air (Apriyantono et al., 1989) Cawan Alumunium yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya diisi sebanyak 2 g contoh lalu ditimbang (W 1 ) kemudian dimasukkan ke dalam oven suhu 105 o C selama 1 2 jam. Cawan alumunium dan contoh yang telah dikeringkan dimasukkan ke dalam desikator kemudian ditimbang. Pemanasan contoh diulangi hingga didapat bobot konstan (W 2 ). Sisa contoh dihitung sebagai total padatan dan air yang hilang sebagai kadar air. Kadar Air (%) = (W 1 W 2 ) x 100 % W 1 2. Analisis Kadar Abu (AOAC, 1995) Sebanyak 2 g contoh ditimbang dalam cawan porselin yang telah diketahui bobotnya (A), kemudian diarangkan dengan menggunakan pemanas bunsen hingga tidak mengeluarkan asap lagi. Cawan porselin berisi contoh (B) yang sudah diarangkan kemudian dimasukkan dalam tanur bersuhu 600 o C selama 2 jam untuk mengubah arang menjadi abu (C). Cawan porselin berissi abu didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga mencapai bobot tetap. Kadar Abu (%) = (C A) x 100 % B 3. Analisis Kadar Serat Kasar (Apriyantono et al., 1989) Sebanyak 2 4 g contoh ditimbang, lalu lemaknya dibebaskan dengan cara ekstraksi menggunakan Soxhlet atau diaduk, mengenaptuangkan contoh dalam pelarut organik sebanyak tiga kali. Contoh dikeringkan dan ditambahkan 50 ml larutan H 2 SO 4 1,25% lalu dididihkan selama 30 menit dengan pendingin tegak. Setelah itu ditambahkan 50 ml NaOH 3,25% dan dididihkan kembali selama 30 menit. Dalam keadaan panas cairan disaring dengan corong Buchner yang berisi kertas saring tak berabu Whatman yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya. Endapan pada kertas saring 66
berturut-turut dicuci dengan H 2 SO 4 1,25% panas, air panas dan etanol 96%. Kertas saring dan isinya diangkat dan ditimbang, lalu dikeringkan pada suhu 105 o C sampai bobotnya konstan. Bila kadar serat kasar lebih besar dari 1%, kertas saring beserta isinya diabukan dan ditimbang hingga bobotnya konstan. a. Serat Kasar < 1% (kertas saring+contoh kering) kertas saring kosong x 100% bobot contoh b. Serat Kasar > 1% (kertas saring+contoh kering) kertas saring kosong bobot abu x 100% bobot contoh 4. Analisis Kadar Protein (AOAC, 1995) Sebanyak 0,1 g contoh dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl lalu ditambahkan 2,5 ml H 2 SO 4 pekat, 1 g katalis, dan beberapa butir batu didih. Larutan didestruksi hingga menghasilkan larutan jernih kemudian didinginkan. Larutan hasil dekstruksi dipindahkan ke alat destilasi dan ditambahkan 15 ml NaOH 50%. Labu erlenmeyer yang berisi 25 ml HCl 0,02 N dan 2 4 tetes indikator (campuran metil merah 0,02% dan metil biru 0,02% dalam alkohol (2:1)) diletakkan di bawah kondensor, dengan ujung kondensor terendam dalam larutan HCl. Destilasi dilakukan sampai volume larutan dalam erlenmeyer mencapai 2 kali volume awal. Ujung kondensor dibilas dengan akuades. Destilat dalam labu erlenmeyer dititrasi dengan NaOH 0,02 N hingga diperoleh perubahan warna dari hijau menjadi ungu. Kadar total nitrogen ditentukan berdasarkan volume larutan NaOH 0,02 N yang digunakan untuk titrasi. Blanko disiapkan seperti prosedur penentuan kadar total nitrogen dengan metode Kjeldahl dengan aquades bebas nitrogen sebagai larutan contoh. Penentuan kadar protein dihitung berdasarkan rumus berikut. Total N (%) = ml titrasi (blanko contoh) x N NaOH x 14 x 100 % bobot contoh Kadar Protein (%) = 6,25 x Total N (%) 67
5. Analisis Kadar Lemak (AOAC, 1995) Sebanyak 2 g contoh bebas air (hasil analisis kadar air) diekstraksi dengan pelarut organik heksan dalam alat Soxhlet selama 6 jam. Contoh hasil ekstraksi diuapkan terlebih dahulu dengan cara diangin-anginkan, lalu dikeringkan dalam oven bersuhu 105 o C. Contoh kemudian didinginkan dalam desikator, dan ditimbang hingga diperoleh bobot yang tetap. Kadar Lemak (%) = bobot lemak x 100% bobot contoh 6. Analisis Kadar Pati (AOAC, 1995) Sebanyak 5 g contoh ditimbang dan dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer kemudian ditambahkan 200 ml larutan HCl 3 % dan didihkan selama 3 jam dengan pendingin tegak. Kemudian didinginkan dan dinetralkan dengan larutan NaOH 30 % lalu ditambahkan CH 3 COOH 3 % agar larutan menjadi asam. Isi dipindahkan ke dalam labu berukuran 500 ml dan tambahkan akuades sampai tanda tera, kemudian disaring. Sebanyak 10 ml filtrat di pipet ke dalam erlenmeyer 500 ml, ditambahkan 2 ml larutan Luff Schoorl dan beberapa butir batu didih serta 15 ml akuades. Campuran dipanaskan dengan nyala tetap dan didihkan selama 3 menit. Campuran lalu dididihkan kembali selama 10 menit, kemudian didinginkan dalam bak berisi es. Setelah campuran dingin ditambahkan 15 ml larutan KI 20 % dan 25 ml H 2 SO 4 25 % dengan perlahan-lahan. Lalu dititrasi dengan menggunakan larutan tio 0,1 N dengan penambahan indikator kanji 0,5 % (a ml). Lakukan juga terhadap blanko dengan perlakuan yang sama (b ml). Kadar Pati (%) = A x faktor pengencer x 0,9 x 100 % mg contoh Keterangan : A = angka tabel Luff Schoorl, berdasarkan selisih ml titrasi (b a) 0,9 = perbandingan kadar glukosa dan pati 68
Lampiran 2. Prosedur Analisis Hidrolisat Pati Sagu 1. ph (AOAC, 1995) Pengukuran ph dilakukan dengan menggunakan ph-meter. Sebelum digunakan ph meter dikalibrasi terlebih dahulu ke dalam ph 4 dan ph 9,2. Setelah dicuci dengan akuades, elektroda dimasukkan ke dalam contoh yang akan diukur ph-nya. Nilai ph adalah nilai yang ditampilkan setelah menunjukkan nilai konstan. 2. Kadar Gula Total dengan Metode Fenol Sulfat (AOAC, 1995) Larutan glukosa standar dengan konsentrasi gula 10, 20, 30, 40, 50 dan 60 µg/ml diambil sebanyak 2 ml. Masing-masing kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1 ml larutan fenol 5%, serta ditambahkan 5 ml larutan H 2 SO 4 pekat dengan cepat. Setelah dibiarkan selama 10 menit, larutan kemudian diukur absorbansinya pada λ = 490 nm. Penetapan konsentrasi total gula pada contoh dilakukan seperti pada penetapan kurva standar, kemudian ditentukan total gula contoh sebagai glukosa. Kurva Standar Fenol 1.0 0.8 y = 0,0146x + 0,0063 R 2 = 0,9962 Absorbansi 0.6 0.4 0.2 0.0 0 10 20 30 40 50 60 70 Konsentrasi Glukosa (µg/ml) Total Gulal Linear (Total Gulal) 3. Kadar Gula Pereduksi dengan Metode DNS (Apriyantono et al., 1989) Sebanyak 10,6 g asam 3,5 dinitrosalisilat dan 19,8 NaOH dilarutkan dalam 1416 ml air. Ke dalamnya ditambahkan 306 g Na-k-tartarat, 7,6 ml fenol yang telah dicairkan pada suhu 105 o C dan 8,3 g Na-metabisulfit. Bahanbahan tersebut dicampur hingga rata. Keasaman dari pereaksi DNS yang 69
dihasilkan ditentukan. Sebanyak 3 ml larutan DNS dititrasi dengan HCl 0,1 N dengan indikator fenolftalein. Banyaknya titran berkisar 5 6 ml. Untuk setiap ml kekurangan HCl 0,1 N pada titrasi, ditambahkan 2 g NaOH. Sebanyak 1 ml larutan standar glukosa atau contoh dipipet, dan ditambahkan 3 ml pereaksi DNS. Larutan tersebut diletakkan dalam air mendidih selama 5 menit, kemudian didinginkan hingga suhu kamar. Pembacaan dengan spektrofotometer dilakukan dengan panjang gelombang 550 nm. Bila diperlukan, contoh diencerkan agar dapat terukur pada kisaran 20 80 % T (Transmitan). Kurva Standar DNS Absorbansi 0.8 0.6 0.4 0.2 y = 4,2149x - 0,2824 R 2 = 0,9978 0.0 0.0 0.1 0.1 0.2 0.2 0.3 Konsentrasi Glukosa (mg/ml) Gula Pereduksi Linear (Gula Pereduksi) 4. Ekuivalen Dekstrosa (Dextrose Equivalent/DE) Ekuivalen dekstrosa (DE) diperoleh dengan membagi nilai gula pereduksi contoh dengan nilai total gula contoh tersebut. DE (%) = kadar gula pereduksi contoh (g/l) x 100% total gula contoh (g/l) 5. Derajat Polimerisasi (DP) Derajat polimerisasi (DP) adalah jumlah unit monomer dalam suatu polimer. Derajat polimerisasi diperoleh dengan membagi nilai total gula (metode fenol sulfat) dengan nilai gula pereduksi contoh. DP (%) = total gula pereduksi contoh (g/l) x 100% kadar gula pereduksi contoh (g/l) 70
6. Kadar Nitrogen dengan Metode Semi Mikro Kjeldahl (AOAC, 1995) Sebanyak 0,1 g contoh dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl lalu ditambahkan 2,5 ml H 2 SO 4 pekat, 1 g katalis, dan beberapa butir batu didih. Larutan didestruksi hingga menghasilkan larutan jernih kemudian didinginkan. Larutan hasil dekstruksi dipindahkan ke alat destilasi dan ditambahkan 15 ml NaOH 50%. Labu erlenmeyer yang berisi 25 ml HCl 0,02 N dan 2 4 tetes indikator (campuran metil merah 0,02% dan metil biru 0,02% dalam alkohol (2:1)) diletakkan di bawah kondensor, dengan ujung kondensor terendam dalam larutan HCl. Destilasi dilakukan sampai volume larutan dalam erlenmeyer mencapai 2 kali volume awal. Ujung kondensor dibilas dengan akuades. Destilat dalam erlenmeyer dititrasi dengan NaOH 0,02 N hingga diperoleh perubahan warna dari hijau menjadi ungu. Kadar total nitrogen ditentukan berdasarkan volume larutan NaOH 0,02 N yang digunakan untuk titrasi. Blanko disiapkan seperti prosedur penentuan kadar total nitrogen dengan metode Kjeldahl dengan aquades bebas nitrogen sebagai larutan contoh. Penentuan kadar protein dihitung berdasarkan rumus berikut. Total N (%) = ml titrasi (blanko contoh) x N NaOH x 14 x 100 % bobot contoh 71
Lampiran 3. Prosedur Analisis Cairan Fermentasi 1. ph (AOAC, 1995) Pengukuran ph dilakukan dengan menggunakan ph-meter. Setelah dicuci dengan akuades, elektroda dapat dimasukkan ke dalam contoh yang akan diukur ph-nya. Nilai ph adalah nilai yang ditampilkan setelah menunjukkan nilai konstan. 2. Total Asam (Dewipadma, 1978) Total asam ditentukan dengan cara titrasi dan dinyatakan sebagai asam laktat. Sebanyak 1 ml contoh dipipet ke dalam erlenmeyer 50 ml, ditambahkan dengan 9 ml air destilata, kemudian dipanaskan untuk menghilangkan CO 2 yang ada. Campuran kemudian dititrasi dengan NaOH 0,1 N dengan indikator fenolftalein. Total Asam (g/l) = ml NaOH x N NaOH x 9 x faktor pengencer ml contoh 3. Total Biomassa (Dewipadma, 1978) Pengukuran biomassa dilakukan dengan penyaringan cairan fermentasi menggunakan kertas saring berpori kecil (Whatman No. 42). Biomassa yang tertahan pada kertas saring kemudian dikeringkan dengan menggunakan oven bersuhu 105 o C, dan ditimbang hingga bobotnya konstan. Biomassa (g/l) = (bobot kertas saring+contoh) bobot kertas saring 4. Efisiensi Pemanfaatan Substrat Efisiensi pemanfaatan substrat diperoleh dengan membagi selisih nilai gula pereduksi awal (A) dan gula pereduksi akhir fermentasi (B) dengan nilai gula pereduksi awal contoh tersebut. Nilai gula pereduksi diukur dengan menggunakan metode DNS (seperti terlihat pada Lampiran 3). Efisiensi Pemanfaatan Substrat (%) = (B A) x 100% A 72
5. Kadar Etanol (AOAC, 1995) Penentuan kadar etanol dilakukan dengan dua cara. Yang pertama menggunakan metode secara tidak langsung dengan penetapan BJ (bobot jenis) hasil destilasi contoh, sedangkan cara yang kedua kadar etanol diukur dengan metode Gas Chromatography (GC). Metode Penetapan BJ (Spesific Gravity) Sebanyak 25 ml contoh dimasukkan ke dalam botol penyuling sambil diukur suhunya, kemudian ditambahkan aquades dengan volume yang sama. Penyulingan dihentikan setelah diperoleh hasil sulingan + 23 ml dan diatur suhunya agar sama dengan suhu pada saat pemipetan. Destilat tersebut dimasukkan ke dalam piknometer 25 ml yang telah diketahui bobotnya (P), selanjutnya ditepatkan hingga tanda tera dengan menambahkan aquades dan ditutup. Dinding piknometer dikeringkan lalu piknometer yang telah berisi destilat tersebut ditimbang (D). Piknometer dicuci dengan aseton, dikeringkan dan dibiarkan hingga mencapai suhu kamar (+ 25 o C). Dengan piknometer tersebut ditentukan pula bobot 100 ml air suling (W). Kadar etanol dapat ditentukan dengan bantuan tabel hubungan antara bobot jenis dengan kadar etanol pada berbagai suhu. Bobot jenis destilat = D P W P Metode Gas Chromatography (GC) Penentuan kadar etanol dengan metode GC dilakukan dengan membandingkan waktu retensi contoh dengan waktu retensi standar etanol. Konsentrasi standar etanol yang diinjeksikan adalah 1 % (v/v). kadar etanol yang terdapat dalam contoh dihitung dengan menggunakan persamaan berikut. Kadar Etanol (%) = luas area contoh x [standar] luas area standar 73
Lampiran 4. Neraca Massa Produksi Hidrolisat Pati Sagu Secara Asam Dengan H 2 SO 4 Sebagai Penghidrolisis M pati sagu = 80 g Pencampuran M H2SO4 (0,5 N) = 420 g Gelatinisasi (T = 100 o C, t = 10 menit) M air = 2,75 g Hidrolisis (T = 121 o C, t = 30 menit) M air = 9,55 g M NH4OH (3N) = 41,40 g Netralisasi ph (ph = 4,5-5) M karbon aktif = 1,61 g Purifikasi (T = 80 o C t = 1 jam) M air = 26,76 g M hidrolisat pati sagu = 503,95 g 74
Lampiran 4. Neraca Massa Produksi Hidrolisat Pati Sagu Secara Asam (Lanjutan) Dengan HCl Sebagai Penghidrolisis M pati sagu = 80 g Pencampuran M HCl (0,5 N) = 420 g Gelatinisasi (T = 100 o C, t = 10 menit) M air = 5,57 g Hidrolisis (T = 121 o C, t = 30 menit) M air = 7,30 g M NH4OH (3N) = 37,07 g Netralisasi ph (ph = 4,5-5) M karbon aktif = 1,61 g Purifikasi (T = 80 o C t = 1 jam) M air = 25,54 g M hidrolisat pati sagu = 500,27 g 75
Lampiran 5. Hasil Pengukuran Laju Pembentukan CO 2 Substrat Fermentasi Jam Ke- Laju Pembentukan CO 2 (ml) U 1 U 2 U 3 Rata-Rata Sirup glukosa teknis 0 0 0 0 0,0 6 18 18 26 20,7 12 52 52 57 53,7 18 66 69 78 71,0 24 83 76 92 83,7 30 55 53 68 58,7 36 53 49 61 54,3 42 50 40 50 46,7 48 45 31 38 38,0 54 26 20 22 22,7 60 22 14 14 16,7 66 17 12 10 13,0 72 12 8 7 9,0 Substrat Fermentasi Jam Ke- Laju Pembentukan CO 2 (ml) U 1 U 2 U 3 Rata-Rata Hidrolisat asam H 2 SO 4 0 0 0 0 0,0 6 17 9 18 14,7 12 51 42 53 48,7 18 58 74 65 65,7 24 66 83 77 75,3 30 50 62 68 60,0 36 42 48 55 48,3 42 40 38 50 42,7 48 29 21 40 30,0 54 26 11 38 25,0 60 9 4 18 10,3 66 5 2 6 4,3 72 0 0 0 0,0 76
Lampiran 5. Hasil Pengukuran Laju Pembentukan CO 2 (Lanjutan) Substrat Fermentasi Jam ke- Laju Pembentukan CO 2 (ml) U 1 U 2 U 3 Rata-Rata Hidrolisat asam HCl 0 0 0 0 0,0 6 14 7 4 8,3 12 33 38 33 34,7 18 35 42 41 39,3 24 12 23 31 22,0 30 4 4 9 5,7 36 1 3 5 3,0 42 0 3 2 1,7 48 0 2 2 1,3 54 0 0 0 0,0 60 0 0 0 0,0 66 0 0 0 0,0 72 0 0 0 0,0 77
Lampiran 6. Kromatogram Etanol Hasil Fermentasi 78
Lampiran 6. Kromatogram Etanol Hasil Fermentasi (Lanjutan) 79
Lampiran 6. Kromatogram Etanol Hasil Fermentasi (Lanjutan) 80
Lampiran 7. Hasil Perhitungan Kadar Etanol Metode GC Standar etanol yang digunakan = 1% (v/v) dengan bobot jenis 7,9 g/l Kadar Etanol (%) = luas area contoh x 1% luas area standar Jenis Substrat Sirup glukosa teknis (U 1 ) Hidrolisat asam H 2 SO 4 (U 3 ) Hidrolisat asam HCl (U 2 ) Luas Area Standar Luas Area Contoh Kadar Etanol (% v/v) Kadar Etanol (g/l) 1291310 3307528 2,56 20,41 1291310 2461920 1,91 16,32 1291310 807200 0,63 5,31 81
Lampiran 8. Hasil Analisa Cairan Fermentasi Jenis Substrat Ulangan Biomassa X (g/l) X-Xo Substrat S (g/l) So-S (g/l) Produk *) P (g/l) Sirup glukosa teknis 1 1,140 0,182 57,082 33,082 20,235 2 1,121 0,137 54,137 37,534 20,224 3 1,192 0,163 51,877 34,521 20,777 Hidrolisat asam H 2 SO 4 1 1,202 0,441 63,934 29,966 17,459 2 1,142 0,399 59,760 30,073 15,062 3 1,174 0,528 61,580 31.036 16,432 Hidrolisat asam HCl 1 1,001 0,213 85,338 10,702 5,767 2 1,135 0,240 88,442 9,632 5,214 3 0,918 0,120 86,729 9,204 4,938 *) kadar etanol hasil uji piknometer 82