TES PRAKTIKUM BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER Olimpiade Sains Nasional (OSN) XIV 1-7 September 2014, Mataram, Nusa Tenggara Barat Part A: Identifikasi plasmid dan elektroforesis DNA Part B: Analisis pertumbuhan sel Waktu : 80 Menit NAMA SEKOLAH KELAS
Part A: Identifikasi plasmid dan elektroforesis DNA Pengantar Setelah berhasil memperoleh medali emas di IBO 2014, Valen memperoleh kesempatan gratis melakukan internship di Lab Prof. Tobi. Saat ini Lab Tobi sedang mengembangkan proses produksi senyawa anti jamur (tobisilin) dari salah satu bakteri tanah yang terkenal susah dikultur dengan memindahkan gen penghasil protein untuk sintesis senyawa tobisilin dari bakteri tersebut (selanjutnya disebut gen X) ke E.coli. Pemindahan gen ke E.coli dimaksudkan untuk proses produksi yang lebih cepat dan murah. Valen diminta melakukan proses PCR untuk isolasi gen X dan mengklonnya ke plasmid prt (mengandung gen untuk resistensi ampisilin, dan kompatibel untuk screening biru putih ketika terinsersi oleh gen asing) dengan bantuan reaksi restriksi dan ligasi. Campuran DNA hasil ligasi selanjutnya ditambahkan ke sel E.coli kompeten, dan seleksi resistensi ampisilin serta screening biru putih digunakan untuk mengisolasi koloni E.coli transforman yang mengandung plasmid prt-gen X. Pada praktikum ini anda diminta membantu Valen untuk melakukan salah satu uji konfirmasi bahwa koloni transforman yang ia isolasi benar mengandung plasmid prt-gen X. Konfirmasi dilakukan dengan menggunakan analisis restriksi dan elektroforesis DNA dari isolat plasmid yang diperoleh dari kultur transforman. BamHI 750 bp (gen X) 2850 bp Plasmid prt-genx 3600 bp HindIII Gambar 1. Plasmid prt-genx Tugas dan petunjuk: 1. Waktu ujian adalah 80 untuk part A dan part B 2. Tulis jawaban anda dengan menggunakan pulpen/pena di Lembar Jawaban yang telah disediakan 3. Lengkapi identitas anda pada lembar soal/jawaban di awal pekerjaan. Anda dilarang keras bekerja ketika waktu ujian telah selesai. Peserta yang masih tetap melanjutkan pekerjaan akan memperoleh nilai 0 pada ujian biologi sel dan molekuler 4. Pada tes praktikum ini anda diminta untuk: - Menyiapkan reaksi restriksi - Mengelektroforesis sampel DNA hasil restriksi
- Menyimpan gel agarose hasil elektroferesis untuk dapat dikumpulkan dan dinilai oleh asisten - Menjawab soal teori part B 5. Bagian Protokol berisi metode penyiapan reaksi restriksi dan elektroforesis DNA 6. Untuk menyalakan alat elektroforesis anda akan dibantu oleh asisten. JANGAN menyalakan alat oleh anda sendiri. 7. BERHATI-HATILAH dalam bekerja. - Volume sampel yang diberikan sangat terbatas. Teliti dalam mengambil dan memindahkan larutan, dan bedakan penggunaan teknik pipetting menggunakan tombol stop 1 dan stop 2. - Elektroforesis dilakukan pada tegangan 100 Volt. JANGAN sekalikali memasukkan tangan anda ke dalam gel chamber ketika elektroforesis sedang berlangsung Penilaian - Kesesuaian Pita DNA hasil elektroforesis (Nilai 50): Ladder (Nilai @ 5), Uncut (Nilai 10), Single cut dengan Bam HI (15), Double cut dengan BamHI dan HindIII (Nilai 15) - Tes teori (Nilai 50) Alat dan Bahan Bahan Quantity Unit restriction endonucleases RE1 (BamHI) (disimpan dalam kotak es) 1 (5 L) tube restriction endonucleases RE2 (HindIII) (disimpan dalam kotak es) 1 (5 L) tube 10X Restriction buffer solution (dilabel B) (disimpan dalam kotak es) 1 (8 L) tube Sampel larutan plasmid (dilabel 1) (disimpan dalam kotak es) 3 (5 L) tube Sterile water (dilabel W) (diletakkan di rak mikrotube) 1 (500 L) tube Gel red-dna staining solution (dilabel S; di dalam mikrotube berwarna hitam) (diletakkan di rak mikrotube) 1 (100 L) tube DNA ladder stock solution (dilabel L) (size markers for 75-20,000 bp range. (disimpan dalam kotak es) 1 (20 L) tube Equipment DNA electrophoresis gel tank dan power supply (1 power supply untuk 2 participants) 1 set micropipettes dan tips in boxes (p10, p200) 2 pieces Stopwatch 1 piece Ready gel agarose (diletakkan di dalam plastik box 1 piece Running buffer 1 (300 ml) bottle Rak mikrotube 1 piece Mikrotube steril 3 pieces Plastic box (untuk menyimpan gel setelah elektroforesis) 1 piece Water bath 37ºC (terdapat dua pada tiap ruangan. Anda akan dibantu oleh asisten untuk meletakkan dan mengambil sampel ke dan dari Waterbath) 1 set
Floating rack styrofoam 1 piece Micro-centrifuge. Untuk spin down dan pencampuran larutan 1 set Pulpen marker (permanent ink) 1 piece Kartu Meja 1 piece Kertas Label 1 piece Protokol: I. Penyiapan reaksi restriksi 1) Untuk melakukan identifikasi plasmid menggunakan analisis restriksi, anda diminta untuk membandingkan ukuran DNA prtgen X hasil elektroforesis antara yang tidak dipotong, dipotong dengan satu enzim restriksi, dan dipotong dengan dua enzim restriksi. Siapkan sampel larutan DNA anda yang akan dipisahkan dengan elektroforesis, berdasarkan tabel komposisi larutan di bawah ini. Sebelum bekerja lakukan spin down pada bahan enzim dan buffer yang diberikan untuk mengoleksi semua volume larutan dibagian dasar mikrotube. No. Reagent Sampel larutan DNA Uncut Single cut Double cut 1 Sterile water 8 7 6 2 10 X Restriction buffer solution 1* 1 1 3 DNA Plasmid 1 1 1 4 BamHI 0 1 1 5 HindIII 0 0 1 Total volume 10 10 10 * l a *larutan buffer restriksi ditambahkan karena mengandung komponen yang berfungsi sebagai loading dye, untuk membantu DNA bisa diload ke dalam sumur gel electrophoresis 2) Letakkan sampel reaksi restriksi anda pada floating rack styrofoam dan angkat Kartu Meja Anda untuk meminta asisten menempatkan sampel anda didalam waterbath incubator 37 o C. inkubasi dilakukan selama 10 menit. setelah selesai, angkat kembali kartu anda untuk meminta asisten mengembalikan sampel ke meja anda 3) Tambahkan hanya 1 μl larutan Gel red-dna staining masingmasing ke dalam sampel larutan DNA uncut, single cut dan double cut; dan hanya 2 μl larutan Gel red-dna staining ke dalam larutan DNA ladder stock. lakukan spin down singkat untuk mencampur larutan DNA anda dengan larutan DNA staining. Sampel larutan ini selanjutnya anda gunakan untuk running elektroforesis
II. Elektroforesis DNA 1) Letakkan gel agarose anda ke dalam tangki elektroforesis. Tuangkan seluruh running buffer ke dalam tangki, hingga merendam gel elektroferesis anda 2) Masukkan masing-masing 10 μl larutan sampel DNA dan ladder stock ke dalam sumur elektroforesis dengan skema seperti dibawah ini DNA Ladder Uncut Single Cut Double Cut DNA Ladder 3) Tutup tangki elektroforesis, sambungkan kabel lead dari tangki anda ke power supply (sesuai masing-masing warna), dan angkat kartu meja anda untuk meminta bantuan asisten menyalakan alat elektroforesis. Hitung waktu elektroforesis selama 30 menit, dan jika telah selesai angkat kembali kartu anda untuk meminta asisten mematikan alat. Sambil menunggu elektroforesis anda dapat mengerjakan soal Part B III. Penyimpanan sampel agar 1) Setelah kabel lead dari tangki elektroforesis anda dilepaskan dari power supply, angkat dan pindahkan gel anda pada plastic box yang disediakan (sebelumnya juga digunakan untuk menyimpan gel agarose). 2) Tutup plastic box. Tulis Nama lengkap dan No. peserta anda secara jelas di kertas label, selanjutnya tempel dibagian samping dari plastic box. Gel yang tidak disimpan pada kotak plastic dan tidak diberi label identitas tidak akan dinilai
Part B : Analisis pertumbuhan sel Pada banyak kasus, ekspresi gen rekombinan dapat menurunkan pertumbuhan organisme inang jika dibandingkan dengan yang tidak ditransformasi dengan vektor dan gen asing. Informasi kecepatan pertumbuhan ini nantinya dapat digunakan untuk merancang lebih jauh kondisi kultivasi yang cocok untuk produksi produk tertentu oleh organisme tersebut. Untuk memperoleh preliminary data karakteristik pertumbuhan sel E.coli hasil transformasi dengan plasmid prt-gen X Prof. Tobi melakukan percobaan di bawah ini. I. Pengaruh kehadiran gen X pada pertumbuhan sel E.coli strain Top1 (high level of recombinant gen expression, unusual cell size) Kultur starter E.coli transforman prt-gen X dan non-transforman diinokulasikan pada medium agar pertumbuhan dengan menggunakan metode spread. Pengamatan yang dilakukan 8 jam setelah inokulasi awal menunjukkan adanya 91 colony forming unit (CFU) pada cawan petri A yang mengandung E. coli non-transforman dan 17 CFU pada cawan petri B yang mengandung E. coli transforman. CFU merupakan satuan ukuran populasi bakteri pada media padat, setiap koloni bakteri yang jelas terpisah dari koloni lainnya dihitung sebagai satu CFU. Koloni bakteri ini awalnya berasal dari satu sel bakteri yang mengalami pembelahan terus-menerus menghasilkan sekumpulan bakteri dalam satu koloni. Di akhir inkubasi, diamati kultur sel E. coli memenuhi cawan petri A dan B berturut-turut setelah 24 dan 36 jam. Metode penghitungan plate count yang menggunakan metode pengenceran berseri dilakukan untuk mengetahui jumlah sel yang ada didalam kedua cawan petri tersebut di akhir pengamatan. Berikut adalah cara kerja praktikum yang diberikan oleh Prof. Tobi untuk metode pengenceran berseri : Alat dan Bahan : 1. 10 buah tabung reaksi 2. 4 buah cawan petri berisi agar LB (media padat pertumbuhan bakteri, diameter 100 mm) 3. 50 ml larutan M9 (garam fisiologis, media cair pertumbuhan bakteri) 4. Pipet tetes 5. Pemanas spiritus 6. Pipet sedotan 7. Vortex
Metode : 1. Siapkan 6 tabung reaksi. Isi tube 1 dengan 5 ml larutan M9. Isi tube 2 6 dengan 4.5 ml larutan M9. 2. Ambil bakteri yang terdapat pada area seluas 1 mm x 1 mm pada permukaan agar di cawan petri. Masukkan ke dalam tube 1. Homogenisasi hingga merata menggunakan vortex. 3. Ambil 0.5 ml larutan pada tube 1 dan masukkan ke dalam tube 2. Homogenisasi hingga rata. 4. Lakukan langkah 3 untuk tube 3 hingga 6. 5. Inokulasi cawan petri pertama dengan mengambil 1ml larutan di dalam tube 3. Tuang larutan kedalam cawan petri dan sebarkan hingga merata. 6. Ulangi langkah 5 untuk cawan petri kedua, ketiga dan keempat, masing-masing menggunakan larutan dari tube 3 6. 7. Diamkan kultur pada suhu ruangan. Hitung jumlah CFU yang terbentuk. Setelah masa inkubasi 8 jam, didapatkan hasil sebagi berikut : Cawan A1 (dari tube 3) Cawan A2 (dari tube 4) Cawan A3 (dari tube 5) Cawan A4 (dari tube 6) Cawan B1 (dari tube 3) Cawan B2 (dari tube 4) Cawan B3 (dari tube 5) Cawan B4 (dari tube 6)
Secara statistik, jumlah CFU yang baik untuk digunakan dalam menghitung jumlah sel adalah antara 30-300. Jika CFU terlalu banyak sehingga tidak dapat dibedakan secara jelas dan dihitung jumlahnya secara pasti, maka jumlah CFU dianggap lebih besar daripada 300. Q 2.1 (4 poin @ 0.5 point) Berdasarkan hasil pengamatan diatas, lengkapi tabel yang terdapat pada Lembar Jawaban. *Pengenceran dihitung relatif terhadap sel pada kultur tabung reaksi 1, sehingga tingkat pengenceran dapat dihitung sebagai: Konsentrasi sel pada tube 1 Konsentrasi sel pada tube x Q 2. 2 (2 point) Berdasarkan hasil plate count, berapakah jumlah sel total yang terdapat pada cawan petri? (asumsikan π = 3) Q 2.3 (2 point) Hitung dalam menit waktu yang dibutuhkan oleh sel E.coli pada cawan A dan B untuk membelah. Q 2.4 (8 point @ 0.5) Lengkapi grafik pertumbuhan sel bakteri pada Lembar Jawaban yang menujukkan konsentrasi sel setiap 3 jam. Q 2.6 Tentukan pernyataan dibawah ini Benar (B) atau Salah (S) berdasarkan pengaruh ekspresi Tobisilin terhadap pertumbuhan bakteri No Pernyataan 1 Waktu generasi E. coli yang membawa plasmid prt-gen X lebih lama dibanding E. coli non-transforman 2 Laju pertumbuhan spesifik E. coli yang membawa plasmid prt-gen X lebih besar dibanding E. coli non-transforman 3 Jika bakteri E. coli non-transforman dan E.coli yang membawa plasmid prt-gen X di tumbuhkan pada satu media kultur yang sama, maka setelah 24 jam, anda tidak dapat lagi menemukan plasmid prt-gen X di dalam kultur sel bakteri tersebut II. Analisis Pengaruh Tobisilin pada Siklus Pembelahan Sel HeLa Kemampuan Tobisilin untuk menginhibisi pertumbuhan organisme tangguh (resilient) seperti jamur, membuat Prof. Tobi berpikir apakah Tobisilin dapat juga digunakan untuk menginhibisi sel lain dengan kemampuan pertumbuhan dan daya tahan yang tinggi seperti sel kanker. Prof. Tobi mencoba menyusun percobaan terkait menggunakan flow cytometry dan menugaskan asistennya, Hanna, untuk melakukan eksperimen tersebut.
Eksperimen menggunakan kultur sel HeLa (sel kanker manusia) yang selalu membelah yang diberikan pewarna DAPI untuk berikatan dengan DNA sel tersebut. Kultur sel diamati menggunakan mikroskop fluoresen. Hasil pengamatan menemukan adanya 26 sel dengan DNA terkondensasi pada kultur sel Hela tanpa Tobisilin dan hanya 23 pada kultur sel HeLa dengan Tobisilin. Setelah pengamatan dilakukan, kultur dilewatkan pada alat flow cytometer. Flow cytometer adalah sebuah alat yang dapat menghitung jumlah sel yang telah diwarnai. Flow cytometer bekerja dengan cara melewatkan sel satupersatu melalui sebuah pipa kapiler kecil yang hanya dapat dilewati oleh satu sel. Sel dihitung dengan cara menyinari satu bagian pipa kapiler dengan laser yang menyebabkan fluoresensi pada pewarna DAPI. Fluorensensi yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi pewarna yang terdapat dalam sel. Tabel dibawah menunjukkan jumlah sel yang didapatkan setelah hasil penghitungan dengan flow cytometer: Unit Fluoresensi Relatif Jumlah Sel HeLa HeLa + Tobisilin 0 0 0 40 0 0 80 0 0 120 10 17 140 16 20 160 174 163 200 36 32 240 35 37 280 32 34 320 33 33 360 32 36 400 36 32 440 86 90 480 10 6 Q 3.1. Buat grafik jumlah fraksi sel (dalam persentase dari sel total) terhadap unit fluoresensi relatif. Gambar grafik fraksi sel Hela dan fraksi sel Hela + Tobisilin pada satu grafik yang sama. Gunakan lingkaran (O) untuk menunjukkan fraksi sel Hela, dan kotak ( ) untuk menunjukkan fraksi sel Hela + Tobisilin. Q 3.2. Dengan menggunakan data dari grafik, tentukan pada unit fluoresensi berapa sel dengan masing-masing fase dapat ditemukan.
Q 3.3 Tentukan lama fase sel jika diketahui lama siklus sel adalah 24 jam. Q 3.4 Dari eksperimen ini, kesimpulan apa yang dapat ditarik tentang dampak Tobisilin terhadap lama siklus sel HeLa? Beri tanda X pada jawaban yang tepat! No Pernyataan 1 Tobisilin memperlambat siklus sel HeLa 2 Tobisilin mempercepat siklus sel HeLa 3 Tobisilin tidak mempengaruhi panjang siklus sel HeLa X IV. Kesimpulan Q 4.1 Dari Q.1, Q.2 dan Q.3, organisme mana saja yang terpengaruhi siklus selnya oleh Tobisilin? Beri tanda X pada jawaban sesuai No Organisme 1 Jamur 2 Bakteri 3 Hewan X Q 4.2 Sintesis zat mana saja dibawah ini yang mungkin menjadi target aktifitas Tobisilin? Beri tanda X pada jawaban yang sesuai B A C D
Q 4.3 Menurut Anda, setelah melihat fakta-fakta diatas, alasan apa yang paling tepat menggambarkan mengapa plasmid Tobisilin (prt-gen X) memiliki pengaruh yang diamati pada bakteri? Beri tanda X pada jawaban yang sesuai No Pernyataan X 1 Target Tobisilin adalah zat metabolit bersifat universal yang terdapat pada sel jamur, bakteri dan hewan. 2 Tobisilin mendegradasi protein siklin pada sel eukariot dan prokariot 3 Replikasi dan eksperesi Tobisilin pada sel E. coli menyebabkan beban tambahan yang cukup besar pada metabolism normal E. coli 4 Instabilitas struktural sitoskelet yang diakibatkan oleh Tobisilin menyebabkan gangguan keseimbangan tekanan osmotik pada E. coli