Bab III Materi dan Metode A. Materi Sampel yang digunakan adalah bakteri simbion dari lamun Enhalus acoroides yang ditumbuh di perairan Teluk Awur, Jepara. Isolasi bakteri simbion di laksanakan di laboratorium mikrobiologi, marine Station, Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro, Jepara. Seleksi dan kultur bakteri simbion dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Laut Tropis, Laboratorium Terpadu, Universitas Diponegoro, Semarang. Ekstraksi dan analisa kandungan pigmen di pusat studi karotenoid dan antioksidan, Universitas Kristen Satya Wacana, Salatiga. Bahan kimia uang digunakan dalam proses ekstraksi dan analisis kandungan pigmen alami adalah methanol, asetonitril, gas N2 dan akuades. B. Metode 1. Persiapan Sampel Lamun Sampel lamun dari jenis Enhalus acoroides yang diambil dari laut dicuci dengan air laut steril untuk menghilangkan kotoran, pasir, lumpur dan mikroorganisme epifit yang menempel pada permukaan daun. Selanjutnya sampel dimasukkan ke dalam kantong plastik hitam dan dimasukkan ke 15
dalam cool box. Sampel di bawa ke laboratorium untuk diisolasi bakteri simbionnya. 2. Pembuatan Medium Pembuatan 1000 ml medium Zobell 2216E half strength dilakukan dengan mencampurkan 2,5 gr bacto-pepton, 0,5 gr ekstrak yeast dan 15 gr bactoagar ke dalam 1000 ml air laut, panaskan dan aduk hingga homogeny. Selanjutnya medium distrilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121 0 C selama 15 menit. Medium yang telah disterilkan dituangkan ke dalam cawan petri kurang lebih sebanyak 20 ml. Medium tersebut digunakan sebagai medium untuk isolasi dan kultur bakteri simbion dari lamun. 3. Metode Isolasi Bakteri Simbion Sampel lamun E. acoroides yang diperoleh dari laut ditempatkan pada cawan petri steril kemudian dipotong dan dihaluskan menggunakan pisau steril. Proses selanjutnya adalah melakukan seri pengenceran terhadap sampel yang telah dihaluskan. Sebanyak 1 gr sampel dimasukkan ke dalam erlemnayer yang berisi 9 ml air laut steril, diperoleh seri pengenceran 10-1. Seri pengenceran 10-1 diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml air laut steril 16
sehingga diperoleh seri pengenceran 10-2. Pengenceran dilakukan sampai diperoleh seri pengenceran 10-3, 10-4 dan 10-5. Dari setiap seri pengenceran diambil 35 µl sampel dan dimasukkan ke dalam cawan pertri berisi medium Zobell 2216E, ratakan sampel menggunakan spreader. Cawan petri tersebut diinkubasi pada suhu 30 0 C selama 4 x 24 jam. 4. Seleksi dan Pemurnian Isolat Seleksi bakteri dilakukan dengan cara mengambil koloni yang berbeda dari masing masing cawan petri pada tiap seri pengenceran (Radjasa et al., 2007). Bakteri yang tumbuh dipermukaan agar diseleksi berdasarkan warna, bentuk dan tektur koloninya(radjasa et al., 2013). Koloni bakteri yang berbeda dipisahkan menggunakan teknik goresan (streak method) kemudian dipindahkan ke medium yang baru. Selanjutnya cawan petri tersebut diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 3 x 24 jam dan diamati pertumbuhannya. Proses pemurnian berhasil jika bakteri sudah tumbuh dalam bentuk koloni tunggal. Apabila belum terbentuk koloni tunggal bakteri harus dimurnikan lagi menggunakan metode goresan hingga didapatkan kultur murni dalam bentuk koloni tunggal (Marhaeni et al., 2011). Koloni yang sudah murni 17
diamati dan dicatat warna, bentuk dan tektur koloninya. 5. Kultur Bakteri Kultur bakteri dilakukan untuk memperbanyak jumlan biomassa sel bakteri sebelum analisa pigmen. Kultur bakteri yang sudah murni ditanam pada cawan petri yang berisis medium padat, kemudian inkubasi cawan petri tersebut pada suhu 35 0 C selama 4 x 24 jam. Setelah sel bakteri target tumbuh memenuhi permukaan agar, sel dipanen dengan cara dikerok menggunakan Scalpel. Sel bakteri yang didapatkan siap untuk diekstraksi dan dilakukan analaisa pigmen. 6. Ekstraksi Pigmen Sel bakteri berwarna yang didapatkan diekstraksi kandungan pigmennya dengan cara direndam menggunakan metanol (Radjasa et al., 2009). Sampel dididamkan hingga pigmen tengangkat dengan sempurna, hingga pelet sel bakteri menjadi tidak berwarna atau pucat. Ekstrak pigmen dipisahkan dari pelet sel, kemudian ekstrak pigmen yang didapatkan disaring menggunakan kertas saring. Proses selanjutnya ektrak pigmen yang didapatkan dievaporasi dan dikeringkan menggunakan gas nitrogen (N2). 18
7. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Kandungan pigmen pada ekstrak dianalisis menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Shimadzu LC 20-AB dengan kolom fase terbalik ODS, C18, 250 x 4 mm, 5 µm. Fase gerak menggunakan perbandingan metanol:asetonitril 70:30 (v/v). 8. Uji Aktivitas Ekstrak Pigmen Uji Aktivitas Antioksidan Uji aktivitas antioksidan mengacu pada metode 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) (Molyneux, 2004). Ekstrak pigmen dan β Karoten sebagai kontrol positif dibuat dalam serial konsentrasi 100, 250, 500, 750, 1000 ppm. Setiap 1 ml ekstrak dan larutan β Karoten dengan berbagai konsentrasi dikontakkan dengan 4 ml dengan konsentrasi 0,1 mm. Sampel diinkubasi pada ruang gelap selama 30 menit. Selanjutnya sampel diukur absorbasninya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 516 nm. Untuk mengetahui aktivitas antioksidan digunakan rumus : % Peredaman = DPPH o [DPPH ]s [DPPH ]o x 100 % 19
Keterangan : [DPPH]o = Absorbansi larutan kontrol positif (DPPH 0,1 mm) [DPPH]s = Absorbasi Larutan Sampel Uji Aktivitas Antimikrobial Ekstrak pigmen yang diperoleh dibuat dalam serial konesntrasi 100, 250, 500, 750, 1000 ppm, selanjutnya ekstrak pigmen diuji potensi aktivitas antimikrobialnya. Bakteri uji yang digunakan adalah bakteri Multi Drug Resistance jenis Escherichia coli dan Staphylococcus aureus, sedangkan jamur uji yang digunakan adalah Aspergilus flavus dan Candida albicans. Uji potensi ekstrak pigmen sebagai senyawa antimikrobial dilakukan dengan menggunakan metode difusi agar (Radjasa et al., 2007). 100 µl kultur cair bakteri dan jamur patogen dengan kepadatan 10 8 sel/ml diinokulasikan ke permukaan medium agar Zobell 2216E. Enam buah paper diks (8 mm, Advantec, Toyo Roshi, Ltd, Japan) diletakkan dipermukaan medium agar. Lima buah paper disk ditetesi dengan 30 µl ekstrak pigmen dengan konsentrasi 100, 250, 500, 750, 1000 ppm dan satu paper disk ditetesi dengan metanol sebagai kontrol negatif. Hasil uji diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu ruangan. 20
Aktivitas antimikrobial ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening disekitar paper disk. 9. Identifikasi Molekuler Bakteri Simbion Lamun E. acoroides Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan Kit Chelex 100. Sel bakteri yang telah ditumbuhkan selama 24 jam dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml yang berisi 100 µl aquabides, kemudian ditambahkan saponin 0,5% dan didiamkan selama 24 jam pada suhu 4 0 C. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit, supernatan hasil sentrifugasi dibuang. Sebanyak 1 ml Phospate Buffer Saline (PBS 1x) ditambahkan ke dalam tabung eppendorf, kemudian disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit, supernatan hasil sentrifigasi dibuang. Selanjutnya sebanyak 100 µl akuabides dan 50 µl Chelex 100 ditambahkan ke dalam tabung. Sampel direbus selama 10 menit (sampel divortex pada 5 menit pertama). Sentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang mengandung DNA dipindahkan ke dalam tabung eppendorf yang baru dan siap untuk proses Amplifikasi DNA. 21
Amplifikasi DNA Amplifikasi DNA menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) 16s rdna. Perlakuan temperatur yang digunakan pada proses Amplifikasi DNA adalah : denaturasi awal pada 95 0 C selama 3 menit, kemudian 30 siklus (denaturasi pada suhu 95 0 C selama 1 menit, annealing pada suhu 55 0 C selama 1 menit dan ekstensi pada suhu 72 0 C selama 1 menit), kemudian ekstensi pada suhu 72 0 C selama 7 menit dan terakhir 4 0 C ~ (Lee, 2006). Primer yang digunakan untuk PCR 16S rdna adalah primer universal untuk bakteri 27F (5'- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') dan primer spesifik eubacteria 1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') (Isnansetyo dan Kamei, 2003). Campuran bahan-bahan yang digunakan yaitu kit Promega (25 µl) primer 27 F (2,0 µl), primer 1492 R (2,0 µl), DNA template (2,5 µl) dan aquabides (18,5 µl) sehingga total volume 50 µl. Bahan-bahan tersebut dicampur dalam tabung PCR. Visualisasi Hasil Amplifikasi DNA Visualisasi hasil amplifikasi DNA dilakukan melalui elektroforesis dengan cara memasukkan 5 22
μl produk PCR ke dalam sumur gel agarose 1 %. Pembuatan gel agarose 1 % dilakukan dengan melarutkan 1 gram agarose dalam 100 ml larutan TAE buffer 1x, lalu dipanaskan menggunakan oven sampai homogen (jernih). Sebanyak 5,33 µl Ethidium Bromide dimasukkan ke dalam larutan gel, kemudian digoyang goyang supaya homogen. Larutan gel dituang dalam cetakan dengan sisir cetakan yang dipasang dengan posisi tegak hingga melewati sisir sesuai dengan ketebalan yang diinginkan. Gel dibiarkan beberapa saat sampai mengeras. Langkah selanjutnya gel direndam dalam larutan buffer TAE 1x, gel kemudian dielektroforesis dengan voltase sebesar 100 V selama ± 30 menit. Terakhir, band DNA hasil amplifikasi dapat dilihat dengan menggunakan alat Gel Documentation. Purifikasi Hasil Amplifikasi DNA Purifikasi dilakukan untuk mendapatkan DNA murni hasil amplifikasi PCR 16S rdna. Metode yang digunakan adalah metode konvensional. Langkah pertama, hasil PCR disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 7 menit. Supernatan dibuang dengan menggunakan micropipet, pastikan DNA benar benar murni (tidak ada primer yang 23
tertinggal). Sebanyak 50 µl akuabides steril ditambahkan pada pelet DNA, diamkan selama 5 menit. Hasil DNA murni dapat disekuensing untuk mengetahui urutan basa DNAnya. Sekuensing DNA Sekuensing dilakukan menurut siklus PCR sekuensing menggunakan Big Dye Terminator v.3.1. Formula untuk reaksi PCR sekuensing yaitu: 2 μl big dye, 2 μl buffer 10x, 4 μl templet DNA, 1 μl primer dengan konsentrasi 3,2 pmol, ddh2o hingga volume akhir 10 μl. Amplifikasi DNA dilakukan dengan siklus sebagai berikut: denaturasi awal (96 C selama 2 menit), kemudian denaturasi (96 C selama 10 detik); annealing (50 C selama 5 detik); dan ekstensi (60 C selama 4 menit) sebanyak 25 siklus. Hasil PCR dipurifikasi dan disekuen menggunakan primer 27F. Sekuen dianalisis secara otomatis (ABI 3130XL, Applied Biosystem). BLAST Homologi Analisis sekuen DNA isolat bakteri terbaik kemudian dibandingkan dengan sekuen DNA pada basis data (database) DNA. Penelusuran dilakukan dengan menggunakan internet melalui program pelacakan database Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) pada National Center for Biotechnology 24
Information, National Institute for Health, USA (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul et al., 1997). Analisa Filogenetik Analisa filogenetik bakteri dilakukan dengan membandingkan sekuen 20 bakteri terdekat dengan haisl sekuensing bakteri EAEJ 1 pada database Gen Bank. Hasil sekuen bakteri EAEJ 1 dan sekuen 20 bakteri terdekat diambil lalu diolah dengan menggunakan program Bioedit dan Mega 5. Dari hasil analisis akan didapatkan pohon filogenetik dari bakteri EAEJ 1 yang menggambarkan kekerabatan dari bakteri tersebut. 25