86 Lampiran Prosedur penentuan lipid serum ) Prosedur analisis kolesterol total Kolesterol total ditentukan dengan metode enzim cholesterol oxidasepaminophenozone (CHODPAP). Prinsip uji Kolesterol dan kolesterol ester dilepaskan dari lipoprotein dengan enzim, selanjutnya dioksidasi secara enzimatik, reaksinadalah: Kolesterol esterase Kolesterol ester +HO kolesterol + asam lemak Kolesterol oksidase Kolesterol + O kolesterol on + H O peroksidase H O + phenol + 4aminoantipyrine Quinoneimine dye + 4 H O Reagen: Reagen enzim (R) mengandung phenol, kolesterol oksidase, kolesterol esterase, peroksidase dan 4aminoantipyrine. Reagen standar (R4) mengandung kolesterol, stabil disimpan pada suhu 8 o C. Prosedur: Panjang gelombang Suhu Kuvet kaca : 500 nm, Hg 546 nm : 7 o C : cm Dipipet ke dalam kuvet Reagen blanko Standar Contoh Standar Standar Standar 0 µl 0 µl Dicampur dengan baik, diukur sesudah diinkubasi pada suhu 7 o C selama 5 menit. Absorbansi contoh dan standar dibaca terhadap RB dalam waktu 60 menit Pengukuran reagen blanko (RB) dilakukan satu kali untuk satu seri pemeriksaan. Perhitungan. Dengan standar Kolesterol = δa contoh/ δa standar x 00 mg/dl atau Kolesterol = δa contoh/ δa standar x 5,6 mmol. Dengan faktor Panjang gelombang C (mg/dl) C (mmol) Hg 546 860 x δa, x δa
87 ) Prosedur analisis HDL Prinsip uji Contoh ditambahkan asam fosfotungsat dan magnesium klorida untuk mengendapkan kilomikron, VLDL, dan LDL dengan cara disentrifus, supernatan mengandung fraksi HDL, kadarnya ditentukan dengan metode enzimatik. Reagen: Reagen mengandung asam fosfotungsta 0,55 mmol/l dan magnesium klorida 5 mmol. Reagen stabil pada suhu 55 o C Prosedur: a. Presipitasi (Pengendapan) Dipipet ke dalam kuvet Makro Semi Mikro Contoh Reagen presipitasi (tanpa pengenceran) Reagen presipitasi (diencerkan) 500 µl 00 µl 500 µl Dicampur dengan baik, diinkubasi selama 0 menit pada suhu ruang. Sentrifus selama menit pada 0000 g atau 0 menit pada 4000 g/ Setelah disentrifugasi supernatan yang jernih dipisahkan dari endapan dalam waktu satu jam dan tentukan konsentrasi kolestrol dengan metode CHODPAP. b. Penentuan Kolestrol Dippet ke dalam kuvet Akuabidestilata Supernatan HDL Reagen CHODPAP Kolestrol Reagen Blanko 00 µl Contoh 00 µl Dicampur dengan baik, diinkubasi selama 0 menit pada suhu ruang. Sentrifus selama menit pada 0000 g atau 0 menit pada 4000 g/ Setelah disentrifugasi supernatan yang jernih dipisahkan dari endapan dalam waktu satu jam dan tentukan konsentrasi kolestrol dengan metode CHODPAP. Perhitungan Panjang gelombang Makro (mg/dl) Semi Mikro (mg/dl) Hg 546 nm C = 80 x A contoh C = 7 x A contoh 500 nm C = 88 x A contoh C = 0 x A contoh
88 Dengan perhitungan dapat ditentukan: LDLkolesterol (mg/dl) = kolesterol total trigliserida HDLkolestrol atau 5 LDLkolesterol (mmol/l) = kolesterol total trigliserida HDLkolestrol, ) Prosedur Analisis LDL Analisis LDL kolesterol serum ditentukan dengan kit Fluidtest LDL CHOL REF 4 LOT D8 dari Biocon Jerman menggunakan metode presipitasi (pengndapan). Prinsip Uji LDL diendapkan dengan heparin pada titik isoelektrik (ph5,). Setelah disentrifugasi sisda LDL dan VLDL di dalam supernatan dan dapat ditentukan dengan metode enzimatik. Reagen: Reagen mengandung heparin 0,68 g/l, sodium sitrat 0,064 mol/l dan stabilizer %. Reagen ini stabil apabila disimpan pada suhu (8) C. Posedur: a. Presipitasi (Pengendapan) Dippet ke dalam tabung sentrifus Contoh 00 µl Reagen LDL Dicampur dengan baik, didiamkan selama sepuluh menit pada suhu +5 sampai +5 C dan disentrifus selama 5 menit pada 4000 rpm. Setelah disentrifugasi supernatan yang jernih dipisahkan dari endapan dalam waktu satu jam ditentukan konsentrasi kolesterol dengan metode CHODPAP. b. Penentuan Kolesterol Dipipet ke dalam kuvet Reagen Blanko Contoh Akuabidestilata Supernatan HDL Reagen CHODPAP Kolestrol 00 µl 00 µl Dicampur dengan baik, diukur sesudah diinkubasi pada 7 C selama 5 menit atau 0 menit pada suhu 05 C. Dibaca absorbansi contoh terhadap terhadap reagen blanko dalam waktu 60 menit.
89 Perhitungan: Panjang gelombang Makro (mg/dl) Hg 546 nm C = 08 x A contoh 500 nm C = 950 x A contoh LDL kolesterol = Total kolesterol LDL koleserol supernatan 4) Prosedur Analisis Trigiliserida Serum Analisis trigiliserida serum ditentukan dengan kit Fluidtest TG REF 5748 LOT D76 dari Biocon Jerman menggunakan metode GPOPAP merupakan uji kolorimetrik enzimatik. Prinsip uji Trigliserida dihidrolisis secara enzimatis menjadi gliserol menurut reaksi berikut. Trigeliserida LPL Gliserol + asam lemak bebas Gliserol + ATP GK GP + ADP GP + O GPO DAP + H O H O + 4aminoantipyrin + pkhlorofenol POD 4H O + Quinonimine Reagen: Reagen R (reagen enzim) dan reagen R4 (standar) stabil bila disimpan pada suhu + sampai +8 C dan terlindung dari cahaya. Prosedur: Panjang gelombang : 500550 nm, Hg 546 nm Suhu : +7 C Kuvet Kaca : cm Pengukuran terhadap reagen blanko (RB) dilakukan satu kali untuk satu seri pemeriksaan. Dipipet ke dalam Reagen Blanko Standar Contoh kuvet Standar/R4 Sampel Reagen kerja 0 µl 0 µl Campur dengan baik, diukur sesudah diinkubasi pada 7 C selama 5 menit. Dibaca absorbansi contoh dan standar terhadap RB dalam waktu 60 menit. Perhitungan Konsentrasi trigliserida dapat dihitung dengan rumus:
90 Trigliserida (mg/dl)= 00xδA contoh/δa standar atau Trigliserida (mmol/l)=,8 x δa contoh/δa standar
9 Lampiran Ratarata berat badan kelinci (gram) selama periode penelitian Minggu ke Kontrol negative Perlakuan Kontrol positif Simvastatin Discodoris sp 0 87± 56 95± 0 890 ± 09 89 ± 8 97± 5 ± 79 04 ± 5 008 ± 4 04± 09 8± 50 070 ± 84 058 ± 50 040± 5 86± 5 069 ± 6 067 ± 6 4 4± 67 ± 90 4 ± 6 067 ± 7 5 67± 5 8± 8 44 ± 40 6 ± 0 6 ± 95 9± 9 46 ± 64 80 ± 7 87± 57 445± 96 ± 56 ± 55 8 68± 44 470± 9 75 ± 05 9 ± 58 9 55± 46± 6 ± 70 99 ± 87 0 7± 49 46± 77 ± 55 97 ± 7 05± 9 56± 48 49 ± 7 07 ± 48 80± 4 507± 49 9 ± 74 97 ± 40
9 Lampiran SGOT dan SGPT darah kelinci setelah minggu perlakuan Perlakuan Ulangan SGOT SGPT Kontrol negatif 46 4 8* 60* 4 Kontrol positif Simvastatin Discodoris sp 77* 5 6 95 87 96 4 75* 46 * Data outlier yang menyebabkan ukuran keragaman >0% 9 48* 78 87 94 99 46 6* 44
9 Lampiran 4 Kandungan plasma darah kelinci selama pengamatan Perlakuan Kontrol negatif Kontrol positif Simvastatin Ulangan Kandungan plasma darah kelinci Kolesterol Trigliserida HDL LDL M0 M4 M8 M M0 M4 M8 M M0 M4 M8 M M0 M4 M8 M 79.8* 4.5 56.* 5.6* 74.0* 4. 4.6 5.5 0.7 4.4 59.8 76. 4.* 0.4 9. 50. 4. 4.5.7.6.9 8.* 50.0*. 6.5 47.6 8.* 64.4 48.0 0. 0. 0.4* 8.4 4.9* 9..6 49.8 46. 4.6 5.6* 5.0* 59. 68. 5. 4.4 5..5* 40.4 65. 68. 4.4 57.7 74.7* 00.5 56.5 00. 8.5 44.6 56.9.0.9* 59.7 08.7 65. 54.8 4.9* 4.4 57. 4.8 05.5 60.7 50.*.8* 40.6 60.9 46.4* 8.4 9.6* 64.5 58.4* 8.8* 68. 656.* 757.9* 5.5 0.6 70.4* 0.5.8 7.5* 40.* 6.9 54.5 9.9 407.9* 505. 50.9* 5. 6.4 8.9* 5.9 4.* 4.6 46.* 7.6 99.* 46.* 5.* 8.5 66.8 40.4 9.4 85.5 46. 78..6.4* 7.5 9.* 96.8 6.* 6. 7.9 6.5 7. 87.5 64.* 74.7 96. 97.6* 9.* 44.7 5.8 9. 0.8 0. 8.0 56.5.9 6. 57. 7.*.8 8. 8.8*. 6.8* 68.4 8.0 5.* 4.6 48.4 5.0 80.9* 06.0 96. 76. 8.0 0. 5.0 Discodoris sp 49.0 44. 9.5 75.6* 75.6 6.4 5.6* 7. 8.7 6.6 46. 46. 0.8 46.* 8.7 5.5.4.9 58. 60.8 06. 9.5 9.8 0.7 87.9 75.0 4. 5.* 50.5* 0.7 0.0 4.* * Data outlier yang menyebabkan ukuran keragaman > 0%
94 Lampiran 5 Persentasi kondisi sel hati yang mengalami kerusakan Perlakuan Ulangan Normal Degenerasi Degenerasi Hidropis lemak Nekrosa 90.9 5.0 0.0.97 Kontrol 9.77 0.00 0.00* 7. negatif 7.7* 66.4* 0.09 6. 4 9.8.4 0.00* 4.40 Kontrol positif Simvastatin Discodoris sp 4.88 5.0 0.00*.0 4.9 5.7.5.76 7.77* 77.0 0.6 4.67 4 7.76 9.6* 7.09* 5.5* 87.6.60*.46 7.67 65.9*.6.59 9. 9.68 9.89 5.04.97* 4 87.76.50* 0.68* 0.07 86.6 0.98* 0.00 6.60 6.67*.0* 0.00 5.4 9.6.57 0.00 7.07 4 8.9 9.69 0.9* 6.74 * Data outlier yang menyebabkan ukuran keragaman > 0% Lampiran 6 Persentase endapan protein pada glomerulus ginjal kelinci percobaan Perlakuan Ulangan Endapan protein * 0* Kontrol negatif. 4.66 Kontrol positif 4 Simvastatin 4 Discodoris sp 4 * Data outlier yang menyebabkan ukuran keragaman >0%.58 0.9*.56.96 7.8 4.94 0* 0* 6.* 9.0 0.76.08
95