BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan selama lima bulan dari bulan Mei hingga September 2011, bertempat di Laboratorium Kimia Hasil Hutan, Bengkel Teknologi Peningkatan Mutu Kayu, Departemen Hasil Hutan, Fakultas Kehutanan, dan Laboratorium Kimia Analitik, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah pohon Suren yang berasal dari Desa Cibadak, Sukabumi. Pohon ini memiliki diameter sebesar 22 cm dan umur 11 tahun. Bagian pohon yang digunakan dalam penelitian adalah bagian kayu teras. Daun yang berasal dari pohon Suren ini dideterminasi di Herbarium Bogoriense LIPI untuk memastikan jenis pohon tersebut secara ilmiah. Bahan lainnya yang digunakan adalah telur A. salina, air laut, kertas saring, pelarut seperti n-heksan, etil asetat, metanol, pereaksi Lieberman-Burchard, H 2 SO 4, FeCl 3, amonia, dan DMSO (Dimethyl Sulfoxide). Pelarut yang digunakan adalah pelarut teknis yang telah disuling dengan menggunakan suhu sesuai titik didih pelarut. Peralatan yang digunakan adalah gelas pelarut seperti labu, erlenmeyer, tabung reaksi, gelas piala, gelas ukur, pipet volumetrik, serta alat berupa Willey mill, Hammer mill, Vacuum Liquid chromatography, kromatografi lapis tipis dan rotary evaporator. 3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Penyiapan Contoh Uji Pada tahapan ini contoh uji diambil dari bagian kayu teras pangkal, tengah dan ujung batang Suren sebagai ulangan. Bagian kayu teras didapatkan dari log dengan menyerut log menggunakan mesin penyerut kayu di Bengkel Teknologi Peningkatan Mutu Kayu untuk memisahkan bagian kayu gubal dengan bagian 10
kayu teras. Bagian teras dibuat hingga ukuran chips dengan menggunakan alat yang sama, kemudian chips tersebut dikeringudarakan. Setelah kering, seluruh contoh uji digiling dengan menggunakan Willey mill dan disaring hingga berbentuk serbuk dengan ukuran seragam (40-60 mesh) dengan menggunakan Hammer mill. Contoh uji yang digunakan adalah sebanyak 1 kg untuk setiap bagian sebagai ulangan. 3.3.2 Ekstraksi dan Fraksinasi Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi secara berkesinambungan dengan menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat, dan metanol. Teknik ekstraksi dengan cara maserasi dilakukan dengan merendam contoh uji sebanyak 1 kg dalam 4 L pelarut n-heksan selama 1 hari pada suhu kamar, kemudian disaring. Perendaman dan penyaringan dilakukan beberapa kali dengan jumlah pelarut yang sama hingga cairan hasil perendaman kelihatan tidak berwarna lagi (bening). Setelah itu, residunya direndam dengan pelarut etil asetat hingga bening dan direndam kembali dengan methanol hingga bening. Teknik ekstraksi dilakukan dengan pengulangan sebanyak 3 kali. Ekstrak dari setiap contoh uji yang dihasilkan dari maserasi kemudian dipekatkan sampai 100 ml dan 250 ml, disesuaikan dengan kepekatan ekstrak dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu sekitar 40-50 o C dan putaran 50 rpm. 3.3.3 Penentuan Kadar Ekstraktif Kadar ekstrak setiap contoh uji dihitung terhadap bobot kering tanur serbuk. Masing-masing contoh uji yang telah dipekatkan diambil 5 ml dan dikeringkan dalam oven pada suhu 103±2 o C untuk mendapatkan berat ekstrak padatan. Penentuan berat ekstrak padatan dilakukan dengan pengulangan sebanyak 2 kali untuk setiap contoh uji dan dibuat rata-rata dari seluruh ulangan tersebut. Berat kering tanur setiap contoh uji diperoleh berdasarkan kadar air serbuk awal. Kadar ekstrak dari hasil ekstraksi dan fraksinasi dihitung terhadap berat kering tanur serbuk dengan menggunakan rumus : 11
Keterangan : Wa = Berat ekstrak padatan (g) Wb = Berat kering tanur serbuk (g) 3.3.4 Uji Bioaktivitas dengan Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Pengujian BSLT diawali dengan penetesan telur, dengan cara menempatkan telur dalam kotak penetesan yang telah berisi air laut. Kotak penetasan diberi lampu pijar, aerasi dan kemudian didiamkan selama dua hari. Kemudian dilakukan penyiapan larutan ekstrak uji. Pengujian dilakukan sebanyak lima variasi konsentrasi, yaitu 1.000 µg/ml, 500 µg/ml, 200 µg/ml, 100 µg/ml, dan 10 µg/ml. Larutan ekstrak uji dibuat 5 variasi konsentrasi dengan konsentrasi dua kali lipat dari pengujian, yaitu 2.000 µg/ml, 1.000 µg/ml, 400 µg/ml, 200 µg/ml, dan 20 µg/ml. Larutan induk dibuat dengan melarutkan 30 mg ekstrak kering dalam 15 ml air laut, bila contoh uji sukar larut ditambahkan beberapa tetes Dimethyl Sulfoxide (DMSO) sebelum penambahan air laut. Larutan induk ini memiliki konsentrasi 2.000 µg/ml. Dari larutan induk dilakukan pengenceran dengan air laut hingga didapat konsentrasi 1.000 µg/ml, yaitu dengan melarutkan 7,5 ml larutan induk dalam air laut hingga 15 ml. Larutan dengan konsentrasi 400 µg/ml didapat dengan pengenceran 6 ml larutan 1.000 µg/ml dengan air laut hingga 15 ml. konsentrasi 200 µg/ml didapat dengan pengenceran 7,5 ml larutan 400 µg/ml hingga 15 ml. Larutan dengan konsentrasi 200 µg/ml diencerkan hingga didapat konsentrasi 20 µg/ml dengan cara yang sama. Pengujian bioaktivitas dilakukan dengan memasukkan 20 ekor larva udang ke dalam tabung reaksi dalam 2,5 ml air laut dan ditambahkan 2,5 ml larutan uji. Penambahan air laut ini menurunkan konsentrasi larutan uji menjadi setengahnya, yaitu 1.000 µg/ml, 500 µg/ml, 200 µg/ml, 100 µg/ml, dan 10 µg/ml. Setiap konsentrasi larutan uji dilakukan 6 kali pengulangan. Kontrol dibuat dengan penambahan DMSO untuk mengetahui pengaruhnya. Setelah 1 hari (24 jam) dilakukan pengamatan dengan menghitung jumlah larva yang mati dan yang hidup. 12
Hasil pengamatan jumlah larva udang yang mati digunakan untuk menghitung mortalitas, yaitu dengan menggunakan rumus: Keterangan: Ma = Mortalitas teramati (%) N1 = Jumlah larva udang yang mati setelah pengujian N2 = Jumlah larva udang awal Nilai mortalitas teramati kemudian dikoreksi dengan mortalitas kontrol. Nilai perhitungan mortalitas terkoreksi dapat dihitung dengan menggunakan rumus dari Abbot (1925) dalam Negara (2005) : Keterangan : MT =Mortalitas terkoreksi (%) Ma =Mortalitas teramati (%) Mk =Mortalitas kontrol (%) 3.3.5 Fraksinasi Fraksinasi dilakukan terhadap ekstrak yang memiliki bioaktivitas paling tinggi pada pengujian. Fraksinasi dilakukan dengan menggunakan metode Vacuum Liquid Chromatography (VLC). Sebanyak 15 g ekstrak dicampurkan dengan sedikit silika gel dan kemudian digerus hingga diperoleh campuran yang berbentuk halus. Timbang 300 g silika gel kemudian tambahkan n-heksan dan aduk hingga merata. Campuran silika dan n-heksan kemudian dimasukkan ke dalam kolom dan diratakan dengan menggunakan alat penggetar hingga tidak terdapat rongga pada kolom. Ekstrak yang telah dicampur dengan silika ditambahkan n-heksan dan kemudian dimasukkan ke dalam kolom sedikit demi sedikit, diratakan dan diberi 13
getaran hingga ekstrak tersebar secara merata. Elusi kolom dilakukan dengan menggunakan n-heksan: etil asetat dan etil asetat: metanol dengan perbandingan yang ditingkatkan secara bertahap sebesar 5%. Elusi diawali dengan n-heksan 100% dan diakhiri metanol 100%. Eluen yang digunakan sebanyak 200 ml untuk setiap perbandingan. Hasil kromatografi ditampung setiap 100 ml ke dalam botol. Setiap larutan di dalam setiap botol dianalisis dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Larutan dalam botol-botol uji yang menunjukkan pola noda yang sama berdasarkan uji KLT digabungkan menjadi satu. 3.3.6 Pengukuran Rendemen hasil fraksinasi VLC Larutan dalam botol uji yang telah diketahui kelompoknya melalui pengujian KLT digabungkan dan kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 40 o C. Setelah ekstrak tersebut kering, ekstrak ditimbang sebagai berat fraksi. Rendemen proses VLC dihitung dengan menggunakan rumus : Rendemen VLC= Hasil fraksinasi ini diuji kembali bioaktivitasnya dengan menggunakan metode BSLT pada konsentrasi yang lebih rendah. 3.3.7 Analisis Fitokimia Kualitatif Fraksi Dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Identifikasi kandungan senyawa pada fraksi dilakukan dengan menggunakan beberapa pereaksi, yaitu H 2 SO 4, Lieberman-Burchard, amonia, dan FeCl 3 10%. Setelah plat KLT dielusi dengan pengembang yang sesuai, plat dikeringkan dan kemudian disemprot dengan menggunakan pereaksi H 2 SO 4. Setelah dilakukan penyemprotan, plat dikeringudarakan dan kemudian dioven pada suhu 103±2 0 C selama 5 menit atau hingga muncul warna pada plat KLT. Aplikasi pereaksi Lieberman-Burchard dan FeCl 3 10% dilakukan dengan cara yang sama. Aplikasi amonia sedikit berbeda dengan pereaksi lainnya. Amonia diuapkan dalam botol hingga jenuh kemudian plat KLT dimasukkan ke dalam 14
botol dan dibiarkan hingga terjadi perubahan warna. Identifikasi terpenoid dan steroid dilakukan dengan menggunakan pereaksi Lieberman-Burchard. Warna merah sampai ungu menunjukkan adanya triterpenoid, sedangkan warna hijau menunjukkan adanya senyawa steroid. Identifikasi senyawa golongan fenolik dilakukan dengan menggunakan pereaksi FeCl 3 10%. Jika timbul warna hitam setelah penyemprotan pereaksi FeCl 3 10% menunjukkan adanya senyawa fenolik dalam ekstrak. Identifikasi senyawa golongan flavonoid dilakukan dengan menggunakan uap amonia. Jika timbul warna kuning atau kuning-coklat setelah pemberian uap amonia menunjukkan adanya flavonoid dalam ekstrak. Bila tanpa pereaksi kimia, di bawah lampu UV 365 nm, flavonoid akan berwarna biru, kuning atau hijau, tergantung dari strukturnya. 3.4 Analisis Data Bioaktivitas Data mortalitas yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan teknik analisis probit untuk mengetahui kematian larva udang A. salina pada tingkat 50% (LC 50 ) dengan menggunakan asumsi distribusi weibull pada selang kepercayaan 95%. Analisis probit dilakukan dengan menggunakan program minitab 14 for windows. 15
Serbuk kayu teras Suren (40-60 mesh) Maserasi dengan n-heksan sampai bening Ekstrak n-heksan Residu Maserasi dengan Etil Asetat sampai bening Ekstrak Etil Asetat Residu Maserasi dengan Metanol sampai bening Ekstrak Metanol Residu Penetapan rendemen dan bioaktivitas Fraksinasi ekstrak potensial Fraksi 1 Fraksi 2 Fraksi 3 Fraksi Penetapan rendemen dan bioaktivitas Penentuan profil KLT Gambar 1 Skema proses penelitian bioaktivitas kayu teras Suren. 16