III. BAHAN DAN METODOLOGI A. Bahan dan Alat 1. Bunga teleng Bunga teleng diperoleh dari tanaman bunga teleng di pekarangan di Kantor Rumah Sains Ilma, Jalan TPU Parakan No. 148 Pamulang Tangerang Selatan. Tanaman ini mulai ditanam pada tanggal 10 Maret 2011 pada lahan seluas 4 m 2. 2. Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini: a. HCl pekat (Brataco, Indonesia) b. 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (Merck, Germany) c. Metanol 96% (Brataco, Indonesia) d. Akuades e. Folin-Ciocalteau phenol reagent (Merck, Germany) f. Asam galat (Merck, Germany) g. Kalium klorida (Merck, Germany) h. Natrium asetat (Brataco, Indonesia) i. Natrium karbonat (AnalaR BDH, England) 3. Alat yang digunakan di dalam penelitian a. Peralatan kaca laboratorium b. UV-Vis Spectrophotometer (Genesys 10uv Thermo Electron Corporation, USA) c. Moisture Analyzer Sartorius MA-35 d. Water-bath shaker e. Hot plate f. Panci kukus
24 B. Metode Penelitian Penelitian ini terbagi menjadi dua tahap, yaitu optimasi proses ekstraksi antosianin bunga teleng dan karakterisasi sifat antosianin bunga teleng hasil optimasi. 1. Optimasi proses ekstraksi antosianin bunga teleng Untuk mendapatkan hasil panen per satuan luas berat hasil panen dibagi dengan luas lahan. Sebanyak 20 helai kelopak bunga diambil dan ditimbang beratnya satu ber satu. Rata-rata dan simpangan baku dari berat kelopak bunga dihitung. Setiap habis dipanen dilakukan pemisahan pangkal. Berat kelopak tanpa pangkal dihitung satu per satu untuk mengetahui sebaran berat kelopak tanpa pangkal. Rendemen dihitung dengan cara membagi berat kelopak tanpa pangkal dengan berat awal dikali 100 %. Kadar air kelopak bunga tanpa pangkal diukur. Sebanyak 10 gram kelopak bunga teleng tanpa pangkal dimasukkan ke plastik HDPE ukuran 250 mg. Plastik dikelim dengan menggunakan panas. Kelopak bunga diblansir dengan uap air suhu 100 o C selama 0 12 menit. Sesudah itu bunga teleng didinginkan dengan cara direndam di dalam penangas es batu. Bunga dikeluarkan dari kantong plastik dan dimasukkan ke labu Erlenmeyer 250 ml yang dibungkus aluminium foil. Sisa bunga dibilas dengan 40 ml pelarut (air-hcl ph 4,5 dengan suhu yang sama dengan suhu ekstraksi, yaitu 30-60 o C). Ekstraksi dilakukan pada water bath shaker dengan suhu 30 60 o C, selama 30 120 menit. Hasil ekstraksi disaring dengan menggunakan kertas saring whatman 40 (8 M), dan ditampung di dalam erlenmeyer yang dibungkus aluminium foil. Sisa padatan diperas secara manual. Cairan yang terpisah dicampurkan dengan hasil penyaringan sebelumnya. Terhadap filtrat yang diperoleh dilakukan pengukuran volum, kadar antosianin dan total fenol. Diagram alir optimasi proses ekstraksi disajikan pada Gambar 5. 2. Karakterisasi sifat antosianin bunga teleng hasil optimasi Terhadap ekstrak hasil proses optimal dilakukan karakterisasi, yaitu profil serapan cahaya pada panjang gelombang antara 200 hingga 700 nm, yang mewakili wilayah serapan cahaya ultraviolet dan cahaya tampak, pengukuran absorbansi atau serapan
Bunga teleng Pemisahan Pangkal Bunga tanpa pangkal Blansir Pendinginan Ekstraksi uap air 100 o C t : 0 12 menit ph 4,5, pelarut 4 ml/g bunga, gelap, pengadukan T : 30-60 o C t : 30-120 menit Penyaringan Ekstrak bunga teleng
26 ml larutan buffer. Untuk ph 1 digunakan larutan buffer KCl 0,02 M (sama dengan yang digunakan untuk analisis antosianin monomerik). Untuk ph 4,5 digunakan larutan buffer CH3COONa 0,4 M (sama dengan yang digunakan untuk analisis antosianin monomerik). Untuk ph 7 digunakan larutan buffer Merck yang terbuat dari kalium dihidrogen fosfat/dinatrium hidrogen fosfat. Kestabilan warna ekstrak bunga teleng pada ph 1 hingga 14 dipelajari dengan mengukur absorbansi maksimum pada masing-masing ph setiap 7 hari selama 28 hari. Larutan ph 1 hingga 14 dibuat dengan melarutkan HCl atau NaOH dalam akuades sehingga mencapai nilai ph yang diinginkan, yang diukur dengan ph meter. Sebanyak 10 ml sampel dicampurkan dengan 90 ml larutan ph 1 hingga 14, kemudian disimpan di dalam botol vial coklat pada suhu ruang dan suhu 4 o C (refrigerator). Untuk mendapatkan panjang gelombang absorbansi maksimal dari masing-masing ekstrak ph 1 hingga 14, sampel dipindai dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm hingga 700 nm. Setiap 7 hari absorbansi setiap sampel diuji pada panjang gelombang maksimalnya. Stabilitas warna dihitung dalam persen yang diperoleh dengan cara membagi absorbansi pada hari ke n dengan absorbansi pada hari ke 0. C. Rancangan Percobaan 1. Optimasi proses ekstraksi antosianin bunga teleng Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah rancangan Box- Behnken dengan metode permukaan tanggap (response surface methodology). Faktor yang dipelajari dan masing-masing tarafnya disajikan pada Tabel 8. Tabel 8 Faktor dan taraf yang dipelajari di dalam penelitian Faktor Satuan Batas bawah (-1) Batas atas (1) Waktu Blansir Menit 0 12 Suhu Ekstraksi o C 30 60 Lama Ekstraksi Menit 30 120 Jika ada 3 faktor yang dipelajari dengan menggunakan rancangan Box-Behnken, maka ada 13 variasi yang perlu dicobakan. Selain itu diperlukan minimal 3 kali ulangan
27 percobaan pada center point (0,0,0). Pada penelitian ini digunakan 5 center point, sehingga jumlah variasi percobaan menjadi 17 (Tabel 9). 2. Karakterisasi sifat antosianin bunga teleng Aktivitas antioksidan ekstrak bunga teleng pada ph 1, 4,5 dan 7 masing-masing diuji sebanyak 3 kali (triplo). Pengukuran serapan maksimal ekstrak bunga teleng pada ph 1 hingga 14 selama penyimpanan dilakukan sebanyak dua kali ulangan (duplo). Tabel 9 Rancangan percobaan dan respons yang diukur di dalam penelitian Std Run Waktu blansir (menit) Suhu Ekstraksi ( o C) Lama Ekstraksi (Menit) 1 1 0 30 75 3 2 0 60 75 7 3 0 45 120 12 4 6 60 120 13 5 6 45 75 5 6 0 45 30 15 7 6 45 75 17 8 6 45 75 9 9 6 30 30 4 10 12 60 75 2 11 12 30 75 11 12 6 30 120 6 13 12 45 30 8 14 12 45 120 16 15 6 45 75 14 16 6 45 75 10 17 6 60 30 Volum Ekstrak (ml) Kadar antosianin (mg/l) Kadar Total Fenol (mg/ml) D. Metode Analisis 1. Analisis Kadar Antosianin Monomerik (AOAC 2005) Kadar antosianin monomerik dinyatakan sebagai kadar cyanidin-3-glycoside yang diukur dengan metode ph Differential. Untuk pengukuran ini diperlukan larutan buffer
28 ph 1 dan 4,5. Larutan buffer ph 1dibuat dengan melarutkan 1,864 g kalium klorida (KCl) dalam 960 ml akuades. Larutan kemudian diukur dengan ph-meter dan ph diatur sehingga mencapai nilai 1 dengan menambahkan asam klorida (HCl) pekat. Larutan ini kemudian dipindahkan ke labu ukur 1 liter dan ditambahkan dengan akuades sampai total volum mencapai 1 liter, sehingga diperoleh larutan buffer KCl 0,025 M ph 1. Larutan buffer ph 4,5 dibuat dengan cara melarutkan 32,814 g natrium asetat (CH 3 COONa) dalam 960 ml akuades. Larutan kemudian diukur dengan ph-meter dan ph diatur sehingga mencapai 4,5 dengan menambahkan HCl pekat. Larutan kemudian dipindahkan ke labu ukur 1 liter dan ditambahkan dengan akuades sampai total volum sama dengan 1 liter, sehingga diperoleh larutan buffer CH 3 COONa 0,4 M ph 4,5. Sebanyak masing-masing 0,2 ml ekstrak diencerkan dengan 1,8 ml larutan buffer ph 1,0 dan larutan buffer 4,5. Absorbansi kedua sampel ini kemudian diukur pada panjang gelombang 510 nm dan 700 nm. Selisih absorbansi dihitung dengan rumus sebagai berikut : A = (A 510 A 700 ) ph 1,0 (A 510 A 700 ) ph 4,5 Kadar antosianin monomerik (cyanidin-3-glucoside equivalents diperoleh dengan rumus sebagai berikut : dalam mg/l) (A MW DF 1000)/(ε l) MW adalah berat molekul cyanidin-3-glucoside (449,2 g/mol), DF adalah faktor pengenceran, ε adalah absorptivitas molar dari cyanidin-3-glucoside yang nilainya sama dengan 26 900, dan l adalah lebar kuvet (1 cm). 2. Analisis Total Fenol (Singleton & Rossi 1965 diacu dalam Kalt et al. 2000) Penentuan kandungan total fenol dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteau dengan asam galat sebagai standar. Sebanyak 0,2 ml sampel direaksikan dengan 0,8 ml larutan Natrium karbonat 20 % dan 1 ml larutan Folin-Ciocalteau. Sampel didiamkan selama 1 jam, kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 765 nm. Untuk membuat kurva kalibrasi sebanyak 0,2 ml larutan asam galat pada berbagai konsentrasi direaksikan dengan 0,8 ml larutan Natrium karbonat 20 % dan 1 ml larutan Folin-
29 Ciocalteau. Kandungan total fenol dihitung sebagai Ekuivalen Asam Galat (EAG) dengan persamaan sebagai berikut : Total kandungan fenol (mg/l EAG) = Abs/m + C Abs adalah Absorbance (A), m adalah kemiringan kurva standar asam galat dan C adalah konstanta (intersep). 3. Aktivitas antioksidan - DPPH radical-scavenging activity (Sanchez-Moreno 2002 diacu dalam Vankar & Srivastava 2010) Larutan kontrol dibuat dengan cara melarutkan 1,5 ml larutan DPPH dalam metanol dengan konsentrasi 0,001396 M dengan 0,5 ml metanol. Absorbansinya diukur pada panjang gelombang 517 nm. Sebanyak 0,1 ml ekstrak bunga teleng diencerkan dengan masing-masing 0,9 ml larutan buffer ph 1, ph 4,5 dan ph 7. Kemudian masingmasing sampel diambil sebanyak 0,1 ml dan ditambahkan dengan 1,5 ml larutan DPPH dan 0,4 ml metanol. Absorbansinya diukur pada panjang gelombang 517 nm. Aktivitas antioksidan dalam satuan Mol DPPH/100 ml ekstrak diperoleh dengan rumus sebagai berikut : (A kontrol A sampel )/A kontrol X mol DPPH X 10 6 X DF Dengan DF adalah faktor pengenceran, A kontrol adalah absorbansi larutan kontrol dan A sampel adalah absorbansi larutan sampel 4. Analisis Permukaan Tanggap Untuk mempelajari pengaruh dari masing-masing faktor dalam bentuk permukaan respons (permukaan tanggap) data diolah dengan menggunakan software Design- Expert Versi 8.0.7.1. Pada prinsipnya uji statistika yang dilakukan berdasarkan kepada analisis sidik ragam atau ANOVA. Taraf signifikan yang dipilih adalah 5 % ( = 0,05). Software akan menghitung nilai p (p-value) dari masing-masing faktor dan interaksi antar faktor. Jika nilainya lebih kecil daripada, maka pengaruh dari faktor tersebut adalah signifikan. Berdasarkan uji signifikansi tersebut, software akan memberikan model persamaan regresi yang menghubungkan antara respons tertentu dengan semua faktor.
30 Pada rancangan Box-Behnken interaksi antar faktor yang dapat disertakan di dalam persamaan hanya terbatas sampai interaksi antara 2 faktor. Berdasarkan model yang diusulkan untuk masing-masing respons software melakukan analisis untuk mendapatkan proses optimal sesuai dengan kriteria yang dibuat. Pada penelitian ini kriteria proses optimal adalah yang mampu menghasilkan ekstrak dengan kadar antosianin, total fenol dan volum yang maksimal. Urutan tingkat kepentingan (importance) yang perlu dipenuhi oleh proses yang optimal adalah kadar antosianin, total fenol dan volum. Untuk menguji kesahihan dari model persamaan yang diusulkan, dilakukan verifikasi. Verifikasi dilakukan dengan cara melakukan 5 ulangan proses ekstraksi dengan menggunakan parameter optimum. Jika nilai rata-rata dari kadar antosianin, total fenol dan volum berada di dalam rentang yang sesuai dengan model persamaan regresi, maka model tersebut dinyatakan sahih.