2.1 Perlakuan Penelitian II. BAHAN DAN METODE Rancangan penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan 5 perlakuan masing-masing 4 ulangan. Adapun perlakuan yang diberikan dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Perlakuan penelitian kinerja imunitas udang vaname Litopenaeus vannamei dalam teknologi bioflok dan probiotik terhadap koinfeksi IMNV (infectious myonecrosis virus) dan Vibrio harveyi Kode Keterangan perlakuan K- K+ Pro BFT Pro+BFT Kontrol Negatif, tanpa penambahan probiotik SKT-b maupun molase, tanpa koinfeksi virus dan bakteri Kontrol Positif, tanpa penambahan probiotik SKT-b maupun molase, serta dikoinfeksi virus dan bakteri Probiotik, diberi penambahan probiotik SKT-b serta dikoinfeksi virus dan bakteri Bioflok, diberi penambahan molase dan dikoinfeksi virus dan bakteri Probiotik+Bioflok, diberi penambahan probiotik dan molase, serta dikoinfeksi virus dan bakteri 2.2 Persiapan Wadah dan Hewan Uji Wadah yang digunakan dalam penelitian ini adalah akuarium dengan ukuran 60 cm x 30 cm x 35 cm. Sebelum digunakan, akuarium dibersihkan terlebih dahulu menggunakan deterjen dan dikeringkan. Kemudian akuarium diisi air laut sebanyak 45 L. Air laut didisinfeksi dengan larutan klorin 30 mg/l dan diaerasi kuat selama 24 jam. Kemudian ditambahkan sodium tiosulfat 15 mg/l untuk menetralkan kandungan klorin dan diaerasi kuat selama minimal 4 jam. Hewan uji yang digunakan adalah udang vaname Litopenaeus vannamei yang berasal dari Labuan, Banten. Sebelum diberi perlakuan, udang vaname dipelihara selama 30 hari. Udang vaname yang digunakan memiliki bobot ratarata 0,48 + 0,03 g. 4
2.3 Persiapan Bakteri Probiotik 2.3.1 Pembuatan Mutan Bakteri Probiotik Vibrio SKT-b (Rf R ) Bakteri probiotik yang digunakan yaitu Vibrio SKT-b yang merupakan hasil penapisan dari media kultur Skeletonema sp. di lingkungan pembenihan udang windu, Labuan Banten (Widanarni et al. 2003). Bakteri Vibrio SKT-b dibuat resisten terhadap antibiotik rifampisin sebagai penanda molekuler untuk membedakan bakteri yang diinokulasikan dengan bakteri yang sebelumnya telah ada pada media pemeliharaan maupun tubuh udang (Ayuzar 2009). Untuk selanjutnya bakteri SKT-b yang telah resisten rifampisin disebut dengan SKT-b R. Bakteri SKT-b R diperoleh dengan menyebar biakan cair SKT-b pada media TCBS agar yang telah diberi rifampisin 50 µg/ml (Ayuzar 2009). Koloni yang tumbuh kemudian kultur kembali untuk mendapatkan isolat murni SKT-b yang resisten terhadap rifampisin. 2.3.2 Kultur Bakteri SKT-b R Kultur bakteri probiotik SKT-b R dilakukan pada media SWC yang diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Kemudian probiotik diinokulasikan ke dalam media SWC cair dan diletakkan pada water bath shaker selama 24 jam dengan suhu 29-30 0 C dengan kecepatan 160 rpm. Setelah 24 jam, didapatkan hasil kultur cair bakteri SKT-b R dengan kepadatan 10 8 CFU/mL. Kultur cair tersebut digunakan sebagai probiotik yang ditambahkan pada media pemeliharaan dengan kepadatan yang diinginkan yaitu 10 4 CFU/mL setiap 5 hari sekali (Saputra 2008). 2.4 Pemeliharaan Udang Uji Udang dipelihara dengan padat tebar 25 ekor/akuarium. Jumlah pakan yang diberikan dengan tingkat pemberian pakan 15 % bobot biomassa dengan frekuensi pemberian pakan 4 kali sehari yaitu pukul 07.00, 11.00, 15.00 dan 20.00. Pemberian molase dilakukan 3 kali sehari 2 jam setelah waktu pemberian pakan. Inokulasi bakteri probiotik dilakukan setiap 5 hari sekali dengan konsentrasi 10 4 CFU/mL. Pemeliharaan udang dilakukan selama 6 minggu (perlakuan). Selanjutnya udang diuji tantang koinfeksi IMNV dan bakteri Vibrio harveyi dengan pengamatan selama 10 hari. Selama pemeliharaan, dilakukan pergantian 5
air satu kali seminggu sebanyak 50 % untuk perlakuan tanpa penambahan karbon (molase), sedangkan untuk perlakuan penambahan karbon tidak dilakukan pergantian air sama sekali selama pemeliharaan udang. 2.5 Prosedur Penambahan Karbon Sumber karbon yang digunakan adalah molase dengan persentase kandungan karbon sebesar 44,42 %. Pemberian karbon dengan C/N rasio 10 (Avnimelech 1999). Penambahan molase pada media pemeliharaan sesuai dengan perhitungan yang dilakukan oleh Avnimelech (1999) (Lampiran 1). 2.6 Prosedur Uji Tantang Uji tantang yang dilakukan adalah koinfeksi virus myo (IMNV) dan bakteri Vibrio harveyi. Udang vaname positif IMNV didapatkan dari Balai Pengembangan Budidaya Air Payau (BPBAP) Situbondo, Jawa Timur yang diekstrak berdasarkan prosedur yang dilakukan Escobedo et al. (2006). Adapun prosedur pembuatan ekstrak IMNV adalah sebagai berikut. Sebanyak 5 ekor udang positif IMNV (bobot rata-rata 10 g) dibersihkan dan dibuang bagian hepatopankreas, usus, dan karapasnya. Kemudian daging udang dicacah hingga halus dan didapatkan hasil cacahan udang positif IMNV dengan volume 10 ml yang dilarutkan dalam PBS sebanyak 100 ml (10x volume daging). Selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 6.500 rpm pada suhu 4 o C selama 20 menit. Supernatan diambil dan dimasukkan dalam mikrotube baru, kemudian disentrifuse dengan kecepatan 13.000 rpm (4 o C) selama 20 menit. Selanjutnya supernatan diambil dan difilter dengan syringe filter berukuran 0,45 µm. Hasil filter itu merupakan stok ekstrak virus IMNV dan disimpan pada suhu -70 o C. Sebanyak 10 ekor udang uji (masing-masing ulangan) dipilih untuk diinjeksi dengan IMNV pada bagian punggung (antara segmen 3 dan 4) sebanyak 100 µl (Tang et al. 2005). Setelah itu dilakukan infeksi selanjutnya yaitu perendaman dengan bakteri Vibrio harveyi berdasarkan prosedur yang dilakukan Widagdo (2011). Sebelumnya dilakukan kultur cair bakteri Vibrio harveyi pada media SWC dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Kemudian didapatkan hasil kultur cair bakteri V. harveyi dengan kepadatan awal 10 8 CFU/mL. Perendaman dilakukan dengan kepadatan bakteri 10 6 CFU/mL selama 30 menit pada akuarium 6
terpisah dengan kepadatan 10 ekor/l. Setelah dilakukan perendaman, udang uji dikembalikan pada akuarium pemeliharaan. Pengamatan dan pemeliharaan setelah koinfeksi dilakukan selama 10 hari. 2.7 Parameter Pengamatan 2.7.1 Parameter Imun Parameter imun udang yang diukur terdiri dari total haemocyte count (THC), aktivitas phenoloxydase (PO), dan respiratory burst (RB) yang dilakukan sebelum dan sesudah uji tantang. Sampel darah diambil dari 8 ekor udang tiap perlakuan yang dipilih secara acak. Prosedur pengukuran parameter imun sebagai berikut: 2.7.2 Total Haemocyte Count (THC) Sebanyak 0,2 ml hemolim udang diambil dengan menggunakan jarum suntik 1 ml yang telah berisi 0,2 ml antikoagulan. Kemudian campuran hemolim-antikoagulan divorteks hingga merata. Campuran hemolim-antikoagulan tersebut kemudian diteteskan pada haemocytometer. Selanjutnya THC langsung dihitung di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x. 2.7.3 Aktivitas Phenoloxydase (PO) (Liu dan Chen 2004) Aktivitas PO haemocyte diukur berdasarkan formasi dopachrome yang dihasilkan oleh L-DOPA (L-dihydroxyphenylalanine). Sebanyak 1 ml campuran hemolim-antikoagulan disentrifuse pada 1.500 rpm selama 10 menit pada temperatur 4 o C. Supernatan dibuang dan pelet disuspensi kembali secara perlahan dengan menambahkan 1 ml larutan cacodylate-citrate buffer (0,01 M sodium cacodylate, 0,45 M sodium chloride, 0,10 M trisodium citrate, ph 7) dan disentrifuse kembali (1.500 rpm selama 10 menit pada temperatur 4 o C). Supernatan yang terbentuk dibuang dan ditambahkan 200 µl cacodylate-citrate buffer (0,01 M sodium cacodylate, 0,45 M sodium chloride, 0,10 M trisodium citrate, ph 7). Suspensi sel sebanyak 100 µl kemudian diinkubasi dengan 50 µl trypsin (1 mg/ml cacodylate buffer) sebagai aktivator selama 10 menit pada temperatur 25-26 o C. Selanjutnya ditambahkan 50 µl L-DOPA (3 mg/ml cacodylate buffer), didiamkan selama 5 menit dan ditambahkan 800 µl 7
cacodylate buffer. Densitas optikal (OD) diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm. Larutan standar mengandung 100 µl suspensi hemosit, 50 µl cacodylate buffer (pengganti trypsin), dan 50 µl L-DOPA. Densitas optikal (OD) dari aktivitas PO dinyatakan sebagai formasi dopachrome dalam 100 µl hemolim. 2.7.4 Respiratory Burst (RB) (Cheng et al. 2004) Respiratory burst dari hemosit diukur berdasarkan reduksi NBT (nitroblue tetrazolium) sebagai ukuran superoxide anion (O - 2 ). Sebanyak 50 µl campuran hemolim-antikoagulan diinkubasi selama 30 menit dalam suhu ruang. Selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 3.000 rpm selama 20 menit dan supernatan dibuang. Ditambahkan 100 µl NBT dalam larutan HBSS (hank's buffered salt solution dengan konsentrasi 0,3 % dan didiamkan selama 2 jam pada suhu ruang. Kemudian disentrifuse 3.000 rpm selama 10 menit, supernatan dibuang dan ditambahkan 100 µl metanol absolut untuk selanjutnya disentrifuse 3.000 rpm selama 10 menit (supernatan dibuang). Pelet yang terbentuk kemudian dibilas sebanyak 2 kali dengan metanol 70 %. Selanjutnya 120 µl KOH (2M) dan 140 µl DMSO (dimethylsulfoxide) ditambahkan untuk melarutkan pelet. Pelet yang telah larut kemudian dimasukkan ke dalam microplate untuk diukur densitas optikal (OD) menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 630 nm. Respiratory burst dinyatakan sebagai reduksi NBT per 10 µl hemolim. 2.7.5 Sintasan Sintasan atau tingkat kelangsungan hidup udang uji dapat diketahui dari jumlah udang pada akhir perlakuan dibagi dengan jumlah udang awal (Effendi 2004), dirumuskan sebagai berikut : Sintasan = [Nt/No] x 100 % Keterangan : No = Jumlah udang pada awal perlakuan (ekor) Nt = Jumlah udang pada akhir perlakuan (ekor) 2.7.6 Perhitungan Bakteri dalam Usus Perhitungan bakteri pada usus udang dilakukan pada awal pemeliharaan, akhir perlakuan dan akhir pemeliharaan (setelah uji tantang). Dilakukan 8
perhitungan populasi bakteri total dan total bakteri Vibrio SKT-b R. Sampel udang diambil sebanyak 4 ekor dari masing-masing perlakuan yang dipilih secara acak. Udang dibedah dan diambil ususnya, kemudian usus ditimbang dan dimasukkan ke dalam mikrotube steril yang berisi air laut steril 1 ml dan digerus. Dari hasil gerusan usus dalam air laut steril dilakukan pengenceran berseri. Selanjutnya hasil pengenceran berseri disebar pada media SWC agar (sea water complete) pada tingkat pengenceran 10-5, 10-6,dan 10-7 untuk perhitungan bakteri total dalam usus. Perhitungan total bakteri Vibrio SKT-b R tidak dilakukan pengenceran berseri (10 0 ) dan langsung disebar pada media TCBS agar (thiosulfate citrate bile-salt sucrose) yang telah diberi rifampisin (50 µg/ml). Perhitungan bakteri dilakukan menggunakan metode hitungan cawan. 2.7.7 Perhitungan Populasi Bakteri Vibrio SKT-b R Media Pemeliharaan Populasi Vibrio SKT-b R pada media pemeliharaan dengan perlakuan probiotik dilakukan setiap 5 hari sekali selama masa pemeliharaan. Sampel air sebanyak 1 ml diambil wadah pemeliharaan perlakuan Pro dan Pro+BFT sebelum dan setelah dilakukan penambahan probiotik SKT-b R, kemudian dilakukan perhitungan bakteri dengan metode cawan sebar pada media TCBS agar yang diberi rifampisin (50 µg/ml) yang diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. 2.7.8 Kualitas Air Pengukuran kualitas air dilakukan dilakukan satu minggu sekali yang meliputi pengukuran suhu, oksigen terlarut (DO), ph, salinitas, total amoniak nitrogen (TAN), nitrat, nitrit, TSS (total suspended solid) dan VSS (volatile suspended solid). 2.8 Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam dengan tingkat kepercayaan 95%. Kemudian dilakukan uji lanjut Duncan dengan menggunakan software SPSS 17.0 untuk melihat perbedaan antar perlakuan. 9