BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Isolasi Bakteri Selulolitik dari Tanah Mangrove Bakteri selulolitik diisolasi dari tanah rhizosfer yang merupakan lapisan tanah tempat perakaran tanaman yang sangat kaya akan nutrisi baik berasal dari eksudat akar maupun dari aktivitas organisme dalam tanah (Rao, 1994). Sampel tanah yang di ambil berasal dari 4 rhizosfer tanaman yang berbeda yaitu pada tanah rhizosfer Avicennia germinans, Avicennia officinalis, Excoecaria agallocha dan Hibiscus tilliaceus. Dari hasil isolasi ditemukan koloni bakteri yang diduga merupakan bakteri selulolitik pada ulangan pertama sebanyak 16 isolat, sedangkan pada ulangan kedua ditemukan sebanyak 11 isolat, dan pada ulangan ketiga ditemukan sebanyak 16 isolat. Sehingga dari hasil isolasi pada ulangan pertama, kedua, dan ketiga didapatkan sebanyak 43 isolat bakteri yang diduga merupakan bakteri pendegradasi selulosa. Pada ulangan pertama koloni bakteri tersebut banyak ditemukan pada tanah rhizosfer A. officinalis, yaitu sebanyak 8 isolat. Namun pada ulangan kedua hanya ditemukan 3 isolat.pada ulangan kedua, pada tanah rhizosfer A. germinans, ditemukan koloni bakteri terbanyak dibandingkan pada ulangan pertama dan ketiga yaitu sebanyak 5 isolat. Sedangkan pada ulangan ketiga ditemukan sebanyak 5 isolat yang jumlahnya lebih banyak dibandingkan dengan isolat yang ditemukan pada ulangan pertama dan kedua. Untuk hasil lebih rinci dapat dilihat pada tabel 4.1.
Tabel 4.1Hasil Isolasi Bakteri Selulolitik pada Tanah Mangrove LOKASI 1. Tanah Rhizosfer Avicennia germinans 2. Tanah Rhizofer Avicennia officinalis 3. Tanah Rhizosfer Excoecaria agallocha 4. Tanah Rhizosfer Hibiscus tilliaceus Keterangan : IS 1 C 1 Angka I menunjukkan ulangan kesatu, S 1 menunjukkan sampel tanah kesatu dan C 1 menunjukkan isolat pertama pada media CMC Pengamatan pertumbuhan bakteri selulolitik dari tanah perakaran mangrove dilakukan pada saat hari ke-5 setelah isolasi. Dari hasil isolasi didapatkan isolat bakteri yang kemudian dipindahkan ke dalam media NA untuk stok kultur. Koloni yang ditemukan pada media CMC agar cawan pada tiga kali pengulangan sebagian besar sama yaitu didominasi oleh koloni putih susu, kuning, berpendar dan transparan. Semua isolat tersebut kemudian dipindahkan ke dalam media NA. Kode Isolat Bakteri yang Ditemukan pada Ulangan Ke- I II III IIS 1 C 1 IIIS IIS IS 1 C 1 C 1 C 1 2 1 IIIS IIS IS 1 C 1 C 1 C 2 3 2 IIIS IIS 1 C 1 C 3 4 IIIS IIS 1 C 1 C 4 5 IS 2 C 1 IS 2 C 2 IS 2 C 3 IS 2 C 4 IS 2 C 5 IS 2 C 6 IS 2 C 7 IS 2 C 8 IS 3 C 1 IS 3 C 2 IS 3 C 3 IS 3 C 4 IS 4 C 1 IS 4 C 2 IIS 2 C 1 IIS 2 C 2 IIS 2 C 3 IIS 3 C 1 IIS 3 C 2 IIS 4 C 1 IIIS 2 C 1 IIIS 2 C 2 IIIS 2 C 3 IIIS 3 C 1 IIIS 3 C 2 IIIS 3 C 3 IIIS 3 C 4 IIIS 4 C 1 IIIS 4 C 2 IIIS 4 C 3 IIIS 4 C 4 IIIS 4 C 5 Jumlah 16 11 16
Setelah dilakukan pemurnian dengan memindahkan isolat pada media NA miringkemudian dilakukan uji screening dengan menanam kembali isolat bakteri tersebut kedalam media CMC agar dan ditumbuhkan selama 5 hari. Menurut Wenzel (2002), aktivitas bakteri dalam mendegradasi selulosa dapat diamati setelah pertumbuhan selama 96-120 jam atau selama 5 hari. Setelah inkubasi selama 5 hari, maka dilakukan uji potensi dalam mendegradasi selulosa yang ada pada media CMC agar yang kemudian ditetesi oleh pewarna Congo red sehingga terlihat adanya zona bening disekitar koloni bakteri selulolitik. Pada hasil uji screening ternyata tidak semua isolat yang diduga merupakan bakteri selulolitik, dapat mendegradasi selulosa. Dari 43 isolat yang ditemukan, hanya 19 isolat yang terbukti mampu mendegradasi selulosa yaitu pada ulangan pertama sebanyak 13 isolat, pada ulangan kedua dan ketiga masingmasing 3 isolat yang menunjukkan hasil positif dengan adanya zona bening (clear zone) saat setelah ditetesi oleh Congo red. Tabel 4.2 menunjukkan isolat yang positif mendegradasi selulosa dan yang tidak.
Tabel 4.2 Hasil uji screening isolat bakteri selulolitik Kode isolat IS 1 C 1 - IS 1 C 2 - IS 2 C 1 + IS 2 C 2 + IS 2 C 3 + IS 2 C 4 + IS 2 C 5 + IS 2 C 6 - IS 2 C 7 + IS 2 C 8 + IS 3 C 1 + IS 3 C 2 + IS 3 C 3 + IS 3 C 4 + IS 4 C 1 + IS 4 C 2 + IIS 1 C 1 - IIS 1 C 2 - IIS 1 C 3 - IIS 1 C 4 - IIS 1 C 5 - IIS 2 C 1 + IIS 2 C 2 - IIS 2 C 3 + IIS 3 C 1 + IIS 3 C 2 - IIS 4 C 1 - IIIS 1 C 1 - IIIS 1 C 2 - IIIS 1 C 3 + IIIS 1 C 4 - IIIS 2 C 1 - IIIS 2 C 2 - IIIS 2 C 3 - IIIS 3 C 1 - IIIS 3 C 2 - IIIS 3 C 3 + IIIS 3 C 4 - IIIS 4 C 1 - IIIS 4 C 2 - IIIS 4 C 3 + IIIS 4 C 4 - IIIS 4 C 5 - Hasil uji Keterangan : + : Hasil uji positif (terdapat zona bening (clear zone)) - : Hasil uji negatif (tidak terdapat zona bening (clear zone)) Selulosa sebagai senyawa yang paling banyak di bumi tersusun atas 8000-12000 unit glukosa dengan ikatan β-1,4-glukosida. Ikatan β-1,4-glukosida pada serat selulosa dapat dipecah menjadi monomer glukosa oleh selulase yaitu
suatu enzim yang terdiri atas tiga tipe enzim utama yaitu endo-1,4-β-glukanase, ekso-1,4-β-glukanase dan 1,4- β-glukosidase (Fikrinda dkk., 2000) Bakteri selulolitik mampu menghasilkan endo-1,4-β-glukanase, ekso-1,4- β-glukanase dan 1,4- β-glukosidase yang bekerja secara sinergis dalam mendegradasi selulosa (Lynd et al., 2002; Badrian and Valášková, 2008 dalam Shukla dan Varma, 2011). Enzim endo-1,4-β-glukanase memecah rantai selulosa secara acak kemudian ekso-1,4-β-glukanase akan menghilangkan glukosa maupun selobiosa dari sisa rantai selulosa yang tidak terdegradasi, dan 1,4-β-glukosidase akan menghidrolisis selobiosa dan molekul selodextrin terlarut lainnya menjadi molekul glukosa (Enari, 1983 dalam Fikrinda dkk., 2000; Bakshi dan Varma, 2008 dalam Shukla dan Varma, 2011). Rantai panjang selulosa yang terdapat di dalam media CMC yang bersifat amorf (tidak beraturan) sangat mudah dipecah oleh bakteri selulolitik (Goto et al., 1992 dalam Fikrinda dkk., 2000), sehingga aktivitas enzim selulase pada substrat CMC merupakan aktivitas enzim endo-1,4-β-glukanase yang bekerja pada rantai dalam CMC menghasilkan oligo-sakarida atau rantai selulosa yang lebih pendek (Meryandini dkk., 2009). Selulosa yang terdapat dalam media CMC pada cawan di sekitar koloni bakteri akan habis digunakan sehingga pada saat pewarnaan dengan Congo redterdapat zona terang karena tidak ada ikatan antara selulosa dan Congo red, sedangkan pada daerahyang masih terdapat selulosa akan berikatan dengan pewarna Congo red dan media akan berwarna merah.
Dari 19 isolat yang menunjukkan hasil positif dengan menunjukkan adanya zona bening (clear zone) kemudian dilakukan pengamatan makroskopis dan mikroskopis koloni. Untuk hasil yang lebih rinci dapat dilihat pada tabel 4.3 Tabel 4.3 Hasil Pengamatan Makroskopis dan Mikroskopis Koloni No Kode isolat Karakter Koloni Karakter Sel Bentuk Warna Tepi Elevasi Bentuk Gram 1. IS 2 C 1 Circular Putih susu Entire Convex Batang Positif 2. IS 2 C 2 Irreguler 3. IS 2 C 3 Irreguler 4. IS 2 C 4 Circular Putih susu Entire Convex Batang Positif 5. IS 2 C 5 Circular Putih susu Entire Convex Batang Positif 6. IS 2 C 7 Irreguler 7. IS 2 C 8 Circular Putih susu Entire Convex Batang Positif 8. IS 3 C 1 Circular Putih susu Entire Convex Batang Positif 9. IS 3 C 2 Circular Putih susu Entire Convex Batang Positif 10. IS 3 C 3 Circular Putih susu Entire Convex Batang Positif 11. IS 3 C 4 Irreguler 12. IS 4 C 1 Circular Kuning Entire Convex Batang Positif 13. IS 4 C 2 Circular Kuning Entire Convex Batang Positif 14. IIS 2 C 1 Circular Putih susu Entire Convex Batang Positif 15. IIS 2 C 3 Irreguler 16. IIS 3 C 1 Circular Kuning Entire Convex Batang Positif 17. IIIS 1 C 3 Circular Putih susu Entire Convex Batang Positif 18. IIIS 3 C 3 Irreguler 19. IIIS 4 C 3 Circular Kuning Entire Convex Batang Positif Berdasarkan tabel morfologi makroskopis dan mikroskopis koloni, isolat IS 2 C 1, IS 2 C 4, IS 2 C 5, IS 2 C 8, IS 3 C 1, IS 3 C 2, IS 3 C 3, IIS 2 C 1, dan IIIS 1 C 3 memiliki karakter morfologi yaitu berbentuk bulat (circular) dengan tepi rata (entire), elevasinya cembung (convex) dan berwarna putih susu serta memiliki bentuk batang dengan
Gram positif. IsolatIS 2 C 2, IS 2 C 3, IS 2 C 7, IS 3 C 4, IIS 2 C 3, dan IIIS 3 C 3 juga memiliki kesamaan karakter morfologi yaitu memiliki bentuk yang tidak beraturan (irregular), dengan tepi rata (entire), elevasi datar (flat) dan berwarna transparan serta berpendar, memiliki bentuk batang dengan Gram negatif. Pada isolat IS 4 C 1, IS 4 C 2, IIS 3 C 1, dan IIIS 4 C 3 memiliki kesamaan morfologi yaitu memiliki koloni dengan bentuk bulat (circular), dengan tepi rata (entire), elevasi cembung (convex) berwarna kuning serta memiliki bentuk batang yang tidak beraturan dan Gram positif. 4.2 Identifikasi Bakteri Selulolitik Bakteri pendegradasi selulosa yang berhasil diisolasi dari tanah di kawasan mangrove wonorejo berjumlah 19 isolat yang kemudian dilakukan identifikasi dengan menggunakan uji fisiologis bakteri untuk mengetahui genus dari bakteri yang ditemukan.karakter fisiologis masing-masing bakteri dapat dilihat pada tabel 4.4.
Tabel 4.4 Karakteristik fisiologis isolat bakteri selulolitik Karakteristik fisiologis Kode Isolat IS 2C 1 IS 2C 2 IS 2C 3 IS 2C 4 IS 2C 5 IS 2C 7 IS 2C 8 IS 3C 1 IS 3C 2 IS 3C 3 IS 3C 4 IS 4C 1 IS 4C 2 IIS 2C 1 IIS 2C 3 IIS 3C 1 IIIS 1C 3 IIIS 3C 3 IIIS 4C 3 Lysine + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Ornithine - - - - - - - - - - - - - - - - - - - H 2S - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Glucose - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Mannitol - + + - - + - - - - + - - - + - - + - Xylose - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ONPG + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Indole - + + - - + - - - - + - - - + - - + - Urease + + + + + + + + + + + + + + + + + + + V-P - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Citrate + + + + + + + + + + + + + + + + + + + TDA - + + - - + - - - - + + + - + + - + + Gelatin + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Malonate + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Inositol - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Sorbitol - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Rhamnose - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Sucrose - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Lactose + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Arabinose - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Adonitol - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Raffinose - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Salicine - - - - - - - - - - - + + - - + - - + Arginine + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Berdasarkan tabel karakteristik fisiologis, isolat IS 2 C 1, IS 2 C 4, IS 2 C 5, IS 2 C 8, IS 3 C 1, IS 3 C 2, IS 3 C 3, IIS 2 C 1, dan IIIS 1 C 3 memiliki kesamaan karakter fisiologis yaitu pada uji dekarboksilase asam amino Lysine, dan Arginine menunjukkan hasil positif namun tidak pada Ornithine. H 2 S tidak diproduksi oleh isolat ini, begitu pula pada uji indole isolat ini menunjukkan hasil yang negatif terhadap pembentukan Indole. Pada uji Urease dan uji penggunaan Citrate, isolat ini menunjukkan hasil positif. Pada uji fermentasi karbohidrat, isolat ini hanya mampu menghidrolisis Lactose dan tidak dapat menghidrolisisinositol, Sorbitol, Rhamnose, Sucrose, Arabinose, Adonitol, Raffinose dan Salicin. Isolat ini juga dapat menghidrolisis ONPG, dan Gelatine namun tidak dapat membentuk acetoin pada V-P, menghasilkan enzim Citrase, dan tidak mendeaminasi Tryptophan pada TDA. Dari hasil uji kenampakan morfologi koloni hingga karakter fisiologis bakteri tersebut, maka kelompok isolat tersebut memiliki karakteristik yang sama dengan genus Bacillus berdasarkan kunci determinasi oleh Koneman et al., (1988) yang dapat dilihat pada lampiran 3. Pada isolat IS 4 C 1, IS 4 C 2, IIS 3 C 1, dan IIIS 4 C 3 memiliki kesamaan karakter fisiologis yaitu pada uji dekarboksilase asam amino yang meliputi dekarboksilase Lysine, dan Arginine menunjukkan hasil positif namun tidak pada Ornithine. H 2 S tidak diproduksi oleh isolat ini. Sedangkan pada uji Indole, isolat ini menunjukkan hasil yang negatif. Pada uji Urease, isolat ini menunjukkan hasil positif begitu pula pada uji penggunaan Citrate, yang juga menunjukkan hasil positif. Sedangkan pada uji fermentasi karbohidrat yang meliputi Inositol, Sorbitol, Rhamnose, Sucrose, Lactose, Arabinose, Adonitol, Raffinose dan
Salicinemenunjukkan hasil yang negatif. Kelompok isolat ini memiliki kesamaan karakter dengan Genus Cellulomonas berdasarkan kunci determinasi pada penelitian yang dilakukan oleh Stackebrandt et al. (2002) yang dapat dilihat pada lampiran3. Isolat IS 2 C 2, IS 2 C 3, IS 2 C 7, IS 3 C 4, IIS 2 C 3, dan IIIS 3 C 3 juga memiliki kesamaan karakteristik pada uji fisiologis seperti pada uji dekarboksilase asam amino Lysine, dan Arginine menunjukkan hasil positif namun tidak pada asam amino Ornithine. H 2 S tidak diproduksi oleh isolat ini. Sedangkan pada uji Indole, isolat ini menunjukkan hasil yang positif. Pada uji Urease, isolat ini menunjukkan hasil positif begitu pula pada uji penggunaan Citrate. Pada uji fermentasi karbohidrat yang meliputi Inositol, Sorbitol, Rhamnose, Sucrose, Lactose, Arabinose, Adonitol, Raffinose dan Salicine menunjukkan hasil yang negatif. Kelompok isolat ini memiliki kesamaan karakter dengan Genus Pseudomonas berdasarkan kunci determinasi pada Bergey s Manual of Determinative Bacteriology Ninth Edition (2000) yang dapat dilihat pada lampiran 3. Dari hasil isolasi dan identifikasi bakteri selulolitik pada tanah mangrove Wonorejo Surabaya didapatkan 3 genus bakteri selulolitik yaitu Bacillus yang ditemukan pada rhizosfer A. germinans, A. officinalis, dan E. agallocha, Pseudomonas yang ditemukan pada rhizosfer A. officinalis, dan E. agallocha, Cellulomonas yang ditemukan pada rhizosfer E. agallocha dan H. tilliaceus. Menurut Rao (1994), bakteri selulolitik yang dapat ditemukan di dalam tanah antara lain: Bacillus, Bacteriodes, Cellafalcicula, Cellulomonas, Cellvibrio, Clostridium, Chromobacterium, Corynebacterium, Cythopaga, Polyangum, dan
Pseudomonas. Namun sampai saat ini belum banyak penelitian yang menyebutkan bakteri-bakteri apa saja yang terdapat di dalam tanah rhizosfer pada mangrove. Keberadaan bakteri selulolitik pada rhizosfer tanaman-tanaman mangrove ini juga dipengaruhi oleh faktor lingkungan di sekitar tempat tumbuh tanaman tersebut, antara lain kelembapan, ph, suhu, dan salinitas. Kelembapan dan ph merupakan faktor yang mempengaruhi kehidupan bakteri di dalam tanah (Rao, 1994). Meskipun berasal dari lingkungan normal (suhu >4 C - <40 C dan ph >5 - <8.5) mikroba selulolitik ada yang mampu menghasilkan selulase yang dapat beraktivitas pada lingkungan ekstrem dan enzim tersebut dapat digunakan dalam banyak aplikasi bioteknologi (Busto et al., 1995 dalam Fikrinda dkk., 2000). Pada lokasi penelitian ini terukur suhu tanah dalam kisaran 26-28 o C yang merupakan suhu normal pertumbuhan bakteri. Aktivitas minimum enzim selulase yang dihasilkan oleh bakteri yaitu pada suhu 25 o C sedangkan aktivitas maksimum pada suhu 60 o C (Yin et al., 2010). ph tanah pada lokasi penelitian ini berkisar antara 6,5-8,5 yang merupakan jenis tanah basa. Pada penelitian yang dilakukan oleh Fikrinda dkk. (2000), bakteri penghasil selulase dapat ditemukan pada kisaran ph 4 hingga 11. Seperti pada Bacillus yang memiliki kisaran ph 4,5-11. Tanah di kawasan mangrove Wonorejo Surabaya juga memiliki salinitas antara 0-25. Menurut Wijiyono (2009), banyaknya bakteri pada kisaran salinitas 10-20 dan 20-30 menunjukkan bahwa tiap organisme memiliki toleransi terhadap salinitas dan pada tingkatan salinitas tertentu merupakan lingkungan yang mendukung bakteri untuk tumbuh dan berkembang.