12 3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari hingga April 2012. Penelitian ini diawali dengan pengambilan sampel dari Balai Riset Pengembangan Budidaya Laut Lampung. Preparasi sampel dilakukan di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku Hasil Perairan, uji proksimat dilakukan di Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, serta untuk proses pengukusan dilakukan di Laboratorium Preservasi dan Pengolahan Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Analisis mineral dilakukan di Laboratorium Pengujian Nutrisi Pakan Fakultas Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor dan analisis vitamin A dilakukan di Balai Besar Industri Agro (BBIA) Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging ikan cobia (Rachycentron canadum) yang diperoleh dari Balai Riset Pengembangan Budidaya Laut Lampung. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk analisis proksimat meliputi akuades, kjeltab jenis selenium, larutan H 2 SO 4 pekat, asam borat (H 3 BO 3 ) 2% yang mengandung indikator bromcherosol green-methyl red (1:2) berwarna merah muda, larutan HCl 0,1 N, pelarut lemak (n-heksana p.a), larutan HCl 10%, larutan AgNO 3 0,10 N, dan akuades. Bahan yang digunakan untuk analisis mineral adalah HNO 3, HClO 4, H 2 SO 4, dan HCl. Analisis vitamin A menggunakan bahan-bahan yaitu akuabides, etanol, KOH, Tetrahidrofouran (THF) dan asam asetat glasial. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah termometer, dandang; analisis proksimat menggunakan alat timbangan analitik, cawan porselen, oven, desikator, tabung reaksi, gelas erlenmeyer, tabung Kjeldahl, tabung sokhlet, pemanas, destilator, buret, kertas saring, kapas dan tanur. Pengujian vitamin A digunakan tabung reaksi, becker glass, mortar, erlenmeyer, magnetic stirer, HPLC Perkin Elmer series 200 dan labu ukur. Analisis mineral menggunakan AAS (Atomic absorption spectrophotometer) merk Shimadzu tipe AA 680 flame emission, hot plate, labu takar 100 ml, dan glass wool.
13 3.3 Metode Penelitian Penelitian meliputi tahap pengambilan sampel, perhitungan morfometrik, perhitungan rendemen, pemasakan, rancangan dan analisis data (SPSS 15.0), analisis kimia ikan cobia berupa analisis proksimat (kadar air, lemak, protein, dan abu), analisis kadar mineral, dan analisis kadar vitamin A. Diagram alir metode penelitian dapat dilihat pada Gambar 1. Ikan cobia Pengukuran berat dan morfometrik Preparasi sampel Pengukuran rendemen Daging ikan segar Pengukusan daging 100 0 C, 15 menit Analisis kimia: 1. Analisis proksimat 2. Analisis mineral 3. Analisis vitamin A Gambar 1 Diagram alir metode penelitian 3.3.1 Pengambilan dan preparasi bahan baku Ikan cobia diambil dari Balai Riset Pengembangan Budidaya Laut Lampung. Sampel yang sudah diambil kemudian dimasukkan dalam coolbox dengan dilapisi es curai, hal ini bertujuan untuk menjaga kesegaran selama proses transportasi. Sampel tiba di laboratorium untuk dilakukan tahap selanjutnya yaitu penentuan morfometrik meliputi ukuran panjang dan lebar, serta penentuan
14 rendemen dengan mengukur berat rata-rata dari setiap jenis sampel secara acak, meliputi berat total, daging, dan jeroan, kemudian dihitung rendemennya dengan rumus: 3.3.2 Proses pengukusan Daging ikan cobia dikukus selama 15 menit pada suhu 100 0 C dengan menggunakan dandang yang terdiri dari dua bagian yaitu bagian bawah untuk air pengukus dan bagian berlubang di atasnya untuk tempat daging ikan. Kemudian ikan diangkat dan ditiriskan kemudian ditimbang, lalu daging dibungkus dengan alumunium foil dan plastik untuk pengujian proksimat, mineral, dan vitamin A. 3.3.3 Rancangan dan percobaan analisis data Rancangan percobaan untuk menguji pengaruh metode pengukusan terhadap kadar proksimat, mineral dan vitamin A ikan cobia adalah dengan metode Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 1 faktor dan 2 taraf (segar dan kukus). Data analisis dengan ANOVA (Analysis of Variance) menggunakan uji F terlebih dahulu. Model rancangan penelitian ini adalah sebagai berikut: y ijk = µ + A i + B j + (AB ij ) + έ ijk Keterangan: y ij = hasil pengamatan faktor A taraf ke-i (I = 1, 2) dan faktor B taraf ke-j (j = 1, 2, 3) pada ulangan ke-k (k = 1, 2, 3) µ = rataan umum A i B j = pengaruh faktor kondisi sampel (faktor A) taraf ke-i = pengaruh faktor jenis pelarut (faktor B) taraf ke-j (AB ij ) = pengaruh interaksi kondisi sampel taraf ke-i dan jenis pelarut taraf ke-j έ ijk = sisaan akibat kondisi sampel taraf ke-i dan jenis pelarut taraf ke-j pada ulangan ke-k Hipotesa terhadap hasil pengujian kadar proksimat, kandungan mineral, dan vitamin A pada daging ikan cobia sebagai berikut: H 0 = Metode pengukusan tidak memberikan pengaruh terhadap kadar proksimat, mineral dan vitamin A. H1 = Metode pengukusan memberikan pengaruh terhadap kadar proksimat, mineral dan vitamin A.
15 Jika uji F pada ANOVA memberikan pengaruh terhadap zat gizi ikan cobia, maka dilanjutkan dengan uji Duncan, rumusnya sebagai berikut: Duncan = q (p,db s ) Keterangan : q = nilai tabel q p = banyaknya perlakuan KTS = Kuadrat tengah sisa db s = Derajat bebas sisa r = Banyaknya ulangan 3.3.4 Analisis proksimat (AOAC 2005) Analisis proksimat yang dilakukan meliputi analisis kadar air, kadar abu, karbohidrat, kadar protein, dan kadar lemak. Analisis yang digunakan mengacu pada metode AOAC. a) Kadar air Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 105 o C selama 1 jam. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (kurang lebih 15 menit) dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Cawan tersebut ditimbang kembali hingga beratnya konstan. Sampel dimasukkan ke dalam cawan dan ditimbang, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 105 o C selama 5-8 jam atau hingga beratnya konstan. Proses selanjutnya cawan tersebut diletakkan pada desikator ± 30 menit dan dibiarkan sampai dingin dan selanjutnya ditimbang kembali. Perhitungan kadar air menggunakan rumus berikut: Keterangan : A = berat cawan kosong (g) B = berat cawan + sampel awal (g) C = berat cawan + sampel kering (g) b) Kadar abu Cawan pengabuan dikeringkan di dalam oven selama 1 jam pada suhu 105 o C, kemudian didinginkan di dalam desikator dan ditimbang hingga
16 didapatkan berat yang konstan. Sampel sebanyak 5 g ditimbang, lalu dimasukkan ke dalam cawan pengabuan dan dipijarkan di atas nyala api bunsen hingga tidak berasap lagi. Setelah itu dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600 o C selama 6 jam, kemudian ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Penentuan kadar abu dihitung dengan menggunakan rumus berikut. Berat abu (g) = berat sampel dan cawan akhir (g) berat cawan kosong (g) c) Kadar lemak Sampel sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam kertas saring pada kedua ujung bungkus ditutup dengan kapas bebas lemak dan selanjutnya sampel yang telah dibungkus dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya dan disambungkan dengan tabung soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak (n-heksana), kemudian dilakukan refluks selama 6 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 o C, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan. Keterangan : W 0 = Berat sampel (g) W 1 W 2 = Berat labu lemak kosong (g) = Berat labu lemak dengan lemak (g) d) Kadar protein Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan metode kjeldahl. Sampel ditimbang sebanyak 2 gram, kemudian dimasukkan ke dalam labu kejldahl 50 ml lalu ditambahkan kjeltab jenis selenium, 15 ml H 2 SO 4 pekat dan 10 ml H 2 O 2 ditambahkan secara perlahan ke dalam labu didiamkan 10 menit di ruang asam. Contoh didestruksi pada suhu 410 o C selama kurang lebih dua jam atau sampai cairan berwarna hijau bening. Labu kjeldahl dicuci
17 dengan akuades 50 hingga 75 ml, kemudian air tersebut dimasukkan ke dalam alat destilasi. Hasil destilasi ditampung dalam erlenmeyer 125 ml yang berisi 25 ml asam borat (H 3 BO 3 ) 4% yang mengandung indikator bromcherosol green 0,1 % dan methyl red 0,1% dengan perbandingan 2:1. Destilasi dilakukan dengan menambahkan 50 ml larutan NaOH ke dalam alat destilasi hingga tertampung 100-150 ml destilat di dalam erlenmeyer dengan hasil destilat berwarna hijau. Lalu destilat dititrasi dengan HCl 0,2 N sampai terjadi perubahan warna merah muda yang pertama kalinya. Volume titran dibaca dan dicatat. Kadar protein dihitung dengan rumus berikut. Keterangan: Protein (%) = N (%) x 6,25 3.3.5 Analisis Mineral Analisis mineral dilakukan untuk mengetahui profil atau komposisi mineral makro dan mikro yang terdapat pada daging ikan cobia. a. Pengujian mineral (Fe, Zn, Ca, K, Mg, Cu, dan Na) Sampel yang akan diuji kadar mineralnya dilakukan pengabuan basah terlebih dahulu. Proses pengabuan basah dilakukan dengan sampel ditimbang sebanyak 1 g, kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer 150 ml. Penambahan 5 ml HNO 3 ke dalam labu dan dibiarkan selama 1 jam. Labu ditempatkan di atas hotplate selama ± 4 jam dan dibiarkan selama semalam dalam keadaan sampel tertutup. Tambahkan 0,4 ml H 2 SO 4 pekat, panaskan di atas hotplate sampai larutan berkurang (lebih pekat). Sebanyak 2-3 tetes campuran HClO 4 dan HNO 3 (2:1) ditambahkan, sampel tetap berada di atas hotplate karena pemanasan terus berjalan hingga terjadi perubahan warna. Setelah ada perubahan warna, pemanasan tetap dilanjutkan 10-15 menit. Sampel dipindahkan, didinginkan dan ditambahkan 2 ml akuades dan 0,6 ml HCl pekat. Larutan contoh kemudian diencerkan menjadi 100 ml dalam labu takar. Sejumlah larutan stok standar dari masing-masing mineral diencerkan dengan menggunakan akuades sampai konsentrasinya berada dalam kisaran kerja logam yang diinginkan. Larutan standar, blanko dan contoh dialirkan ke dalam AAS, kemudian diukur absorbansinya atau tinggi puncak dari standar blanko dan contoh pada
18 panjang gelombang dan parameter yang sesuai untuk masing-masing mineral dengan spektrofotometer. Setelah diperoleh absorbansi standar, antara konsentrasi standar (sebagai sumbu Y) dihubungkan dengan absorban standar (sebagai sumbu X) sehingga diperoleh kurva standar mineral dengan persamaan garis linier y=ax+b yang digunakan untuk perhitungan konsentrasi larutan sampel. Konsentrasi larutan sampel dihitung dengan mengalikan a dengan absorbansi contoh. b. Pengujian fosfor Sebanyak 10 g ammonium molibdat 10% ditambah dengan 60 ml akuades. Selanjutnya ditambahkan 28 ml H 2 SO 4 dan dilarutkan dengan akuades hingga 100 ml (larutan A). Tahap selanjutnya adalah membuat larutan B, sebanyak 10 ml larutan A ditambah dengan 60 ml akuades dan 5 g FeSO 4.7H 2 O, kemudian dilarutkan dengan akuades hingga 100 ml. Sampel hasil pengabuan basah dimasukkan ke dalam tabung kuvet kemudian ditambah dengan 2 ml larutan B. Intensitas warna diukur dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 660 nm. 3.3.6 Analisis vitamin A (AOAC 2001) Prinsip pengujian vitamin A adalah standar dan contoh disabunkan dalam larutan etanol air basa, dinetralkan dan dilarutkan, sehingga mengubah lemak menjadi asam lemak dan ester retinol. Retinol dianalisis menggunakan HPLC dengan detector UV pada panjang gelombang 325 nm. Sebanyak 5 gram contoh uji ditimbang kemudian dimasukkan kedalam erlenmeyer 100 ml, ditambahkan 3 ml aquabides, dan ditambahkan 10 ml etanol 95%. Erlenmeyer lalu digoyangkan untuk memastikan semua bahan tercampur dengan penambahan batu didih untuk mempercepat pemanasan. Tahap berikutnya yaitu ekstraksi dan penyabunan, penangas air dan pendingin kondensor dinyalakan, dipipet 2,5 ml KOH 50% kedalam erlenmeyer contoh, diletakkan dengan cepat diatas penangas air suhu 80 o C dengan pendingin kondensor diletakkan di atas bibir erlenmeyer. Larutan ini direfluks selama 30 menit, setelah itu erlenmeyer diangkat dari penangas, didinginkan hingga suhu ruang, ditambahkan asam asetat glasial 2,5 ml untuk menetralkan KOH, diaduk rata, dan dibiarkan dingin hingga suhu ruang. Larutan ini lalu dipindahkan ke dalam labu
19 ukur 25 ml dan ditera dengan larutan THF : etanol (1:1), setelah itu disaring lalu diendapkan. High performance liquid chromatography (HPLC) merk Perkin Elmer series 200 dinyalakan, dibiarkan stabil selama 30 menit dengan pengaliran fase gerak pada kecepatan 1 ml/ menit. Larutan standar vitamin A yang telah melalui proses penyabunan diinjeksi, lalu diatur fase gerak untuk mendapatkan resolusi bentuk cis dan trans. Semua trans retinol larut dan cis retinol akan larut sebagai sebuah peak kecil sebelum bentuk trans. Deret standar dan contoh diinjeksikan ke dalam botol-botol kecil autosampler lalu diletakkan di dalam HPLC. Standar yang diuji harus masuk kedalam range peak contoh dengan cara standar atau contoh diencerkan. Ekstrak yang berisi vitamin A dapat dianalisis menggunakan HPLC. Sistem yang dianjurkan adalah sebagai berikut: Fase gerak : methanol : air (95:5) Kolom : reverse phase C18 Kecepatan aliran : 1 ml/menit Detektor : UV visible 325 nm