41 METODE PENELITIAN Penelitian ini terdiri atas 2 tahap yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian inti. Penelitian pendahuluan terdiri atas 2 tahap yaitu uji nilai kisaran (range value test) dan uji toksisitas akut merkuri. Sedangkan penelitian inti yaitu pemeliharaan ikan bandeng pada media yang tercemar merkuri dengan salinitas berbeda. Persiapan Penelitian Akuarium yang digunakan sebelumnya dicuci bersih dan diberi desinfektan. Selanjutnya akuarium diisi air sesuai dengan volume pada perlakuan dan diaerasi selama 1 hari agar jenuh oksigen. Sedangkan untuk membuat larutan stok merkuri nitrat dilakukan pelarutan merkuri nitrat ke dalam akuades. Sebelum melakukan penelitian pendahuluan, terlebih dahulu dilakukan aklimatisasi ikan uji. Aklimatisasi ini dilakukan selama seminggu yang bertujuan untuk membiasakan ikan agar dapat hidup dalam suasana laboratorium. Penelitian Pendahuluan Tahap 1 Penelitian pendahuluan tahap 1 adalah melakukan uji nilai kisaran (range value test) merkuri yang bertujuan untuk menentukan ambang batas atas (N) dan ambang batas bawah (n) yang digunakan untuk uji toksisitas akut. Konsentrasi ambang batas atas adalah konsentrasi terendah dari bahan uji yang dapat menyebabkan semua ikan uji mati pada periode waktu pemaparan 24 jam. Sedangkan konsentrasi ambang batas bawah adalah kosentrasi tertinggi dari bahan uji yang dapat menyebabkan semua hewan uji hidup setelah pemaparan 48 jam. Waktu dan Tempat Penelitian pendahuluan tahap 1 ini dilakukan di Laboratorium Lingkungan Departemen Ilmu Akuakultur Fakultas Perikanan IPB. Uji ini dilakukan selama 48 jam.
42 Alat dan Bahan Wadah Percobaan Wadah yang digunakan adalah akuarium dengan ukuran 30 x 30 x 30 cm 3 sebanyak 15 unit. Masing-masing akuarium diisi dengan air sebanyak 20 liter. Media Percobaan Untuk media percobaan digunakan air tawar. Sebelum digunakan air tersebut diendapkan dan diaerasi selama 24 jam agar jenuh oksigen. Bahan Uji Ikan yang digunakan adalah ikan bandeng dengan ukuran 7-8 cm dan bobot 3-5 gram sebanyak 150 ekor dengan padat tebar 10 ekor/akuarium. Sedangkan bahan pencemar yang digunakan adalah Merkuri Nitrat (Hg(NO 3 ) 2 ) dengan penentuan konsentrasi menggunakan metode logaritmik berbasis 10 (lampiran 1) yaitu A (kontrol), B (0.006), C (0.06), D (0.6), dan E (6) mg Hg/l dengan 3 ulangan tiap perlakuan. Perhitungan konsentrasi larutan uji mengacu pada persamaan berikut: V 1 N 1 = V 2 N 2 N 1 V 1 N 2 V 2 : Konsentrasi merkuri dalam larutan stok (mg/l) : Volume larutan stok yang akan diambil (ml) : Konsentrasi merkuri yang diinginkan dalam media air (mg/l) : Volume media air penelitian yang diinginkan (ml) Parameter Pengamatan Selama penelitian, setiap unit akuarium diberi aerasi namun tidak dilakukan pergantian air dan pemberian pakan. Parameter yang diukur adalah mortalitas ikan yang dihitung pada jam ke- 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 dan 24. Sedangkan perhitungan berikutnya dilakukan setiap 6 jam sekali sampai jam ke- 48. Tahap 2 Penelitian pendahuluan tahap 2 adalah melakukan uji toksisitas akut untuk mengetahui toksisitas akut merkuri yang dinyatakan dengan LC 50. Nilai LC 50 yang dilihat adalah nilai yang dapat mematikan ikan pada jam ke 48 dan jam ke 96.
43 Waktu dan Tempat Penelitian pendahuluan tahap 2 ini dilakukan di Laboratorium Lingkungan Departemen Ilmu Akuakultur Fakultas Perikanan IPB. Penelitian ini dilakukan selama 96 jam (4 hari). Alat dan Bahan Wadah Percobaan Wadah yang digunakan adalah akuarium dengan ukuran 30 x 30 x 30 cm 3 sebanyak 15 unit. Masing-masing akuarium diisi dengan air sebanyak 20 liter. Media Percobaan Untuk media percobaan digunakan air tawar. Sebelum digunakan air tersebut diendapkan dan diaerasi selama 24 jam agar jenuh oksigen. Bahan Uji Ikan yang digunakan adalah ikan bandeng dengan ukuran 7-8 cm dan bobot 3-5 gram sebanyak 150 ekor dengan padat tebar 10 ekor/akuarium. Sedangkan bahan pencemar yang digunakan adalah Merkuri Nitrat (Hg(NO 3 ) 2 ). Dari uji nilai kisaran didapatkan bahwa nilai ambang batas atas (N) adalah 0.6 mg Hg/l dan nilai ambang batas bawah adalah 0.06 mg Hg/l. Nilai ambang batas dan ambang bawah ini dimasukkan kedalam rumus menurut Wardoyo (1977), sehingga didapatkan konsentrasi yang akan digunakan dalam uji toksisitas ini. Rumus tersebut adalah sebagai berikut: Log N/n = k (log a log n) a/n = b/a = c/b = d/c = N/d N : Konsentrasi ambang atas n : Konsentrasi ambang bawah k : Jumlah konsentrasi yang diuji a,b,c,d : Konsentrasi yang diuji dengan nilai a sebagai konsentrasi terkecil Rancangan Percobaan Penelitian pendahuluan tahap 2 ini terdiri atas 4 perlakuan dan 1 kontrol dengan 3 ulangan dengan konsentrasi sebagai berikut (Lampiran 1):
44 A B C D E : Tanpa merkuri : 0.110 mg Hg/l : 0.195 mg Hg/l : 0.347 mg Hg/l : 0.618 mg Hg/l Metode dan Parameter Pengamatan Selama penelitian tidak dilakukan pergantian air dan setiap perlakuan diberi aerasi agar kematian ikan tidak disebabkan karena kekurangan oksigen. Parameter yang diukur adalah mortalitas ikan yang dihitung pada jam ke- 0, 6, 12, 18, 24 dan selanjutnya dilakukan perhitungan setiap 12 jam sekali sampai jam ke- 96. Indikator pengamatan tingkah laku ikan uji yaitu gejala Ram-jet ventilation (mulut terbuka terus menerus dan tutup insang terabduksi), frekuensi pernafasan yaitu gerak membuka dan menutup insang/mulut per menit (perhitungan dimulai dari 30 menit setelah pemberian bahan uji dan selanjutnya dibandingkan dengan kontrol), pola gerak renang dan refleksi (normal, diam di dasar, ke permukaan, tidak seimbang, atau kehilangan gerak reflek). Sedangkan pengukuran fisika kimia air dilakukan setiap hari. Analisa Data Untuk dapat menentukan nilai konsentrasi LC 50 dilakukan analisa probit dengan SPSS 17. Analisa probit adalah suatu cara transformasi statistik dari data presentase kematian ke dalam varian yang disebut probit dan kemudian digunakan untuk menentukan fungsi regresi probit dengan log konsentrasi agar dapat mengestimasi LC 50. Penelitian Inti Pada penelitian ini dilakukan penggabungan dari 2 variabel yaitu toksisitas merkuri dengan konsentrasi sama dan salinitas yang berbeda. Tujuan dari penelitian inti ini adalah untuk mengetahui pengaruh salinitas yang berbeda terhadap toksisitas merkuri dan pengaruhnya terhadap kondisi fisiologis ikan bandeng.
45 Waktu dan Tempat Penelitian inti dilakukan di Laboratorium Lingkungan Departemen Ilmu Akuakultur Fakultas Perikanan IPB. Penelitian inti ini dilakukan selama 30 hari. Alat dan Bahan Wadah Percobaan Wadah yang digunakan adalah akuarium dengan ukuran 60 x 30 x 40 cm 3 sebanyak 12 unit. Masing-masing akuarium diisi dengan air sebanyak 40 liter dengan tanpa resirkulasi (static renewal). Media Percobaan Untuk media percobaan digunakan campuran air laut dan air tawar. Sebelum digunakan campuran air tersebut diendapkan dan diaerasi selama 24 jam agar jenuh oksigen. Untuk pergantian air setiap harinya dibuat media stok dengan salinitas 20 ppt, 10 ppt dan air tawar. Bahan Uji Ikan yang digunakan adalah ikan bandeng dengan ukuran 7 8 cm dan bobot 3-5 gram sebanyak 240 ekor dengan padat tebar 20 ekor/akuarium. Bahan pencemar digunakan adalah merkuri dengan konsentrasi 10 % dari LC 50. Pakan Pakan yang digunakan adalah pakan komersil berupa pellet yang akan diberikan dengan frekuensi pemberian pakan 3 kali sehari yaitu pukul 8.00, 12.00 dan 16.00 wib. Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan mengaplikasikan 4 perlakuan dan 3 ulangan. Konsentrasi merkuri yang digunakan mengacu pada hasil penelitian pendahuluan. Satuan percobaan yang digunakan adalah sebagai berikut (Lampiran 1): A : Salinitas 0 ppt tanpa Hg B : Salinitas 0 ppt + 0.012 mg Hg/l C : Salinitas 10 ppt + 0.012 mg Hg/l D : Salinitas 20 ppt + 0.012 mg Hg/l
46 Metode dan Parameter Pengamatan Ikan yang digunakan untuk penelitian inti sebelumnya diaklimasi pada air tawar, salinitas 10 ppt dan 20 ppt selama lebih kurang 5 hari. Untuk mendapatkan media percobaan dengan tingkat salinitas yang sesuai dengan perlakuan yang diterapkan, maka dilakukan pengenceran air laut dengan air tawar (lampiran 2). Sedangkan untuk mendapatkan salinitas yang sesuai dengan perlakuan dilakukan perubahan salinitas secara bertahap dengan perubahan 3 ppt setiap harinya sehingga ikan dapat bertahan dan menyesuaikan diri dengan salinitas yang baru. Selama durasi aklimasi ikan, media pada setiap unit perlakuan diberi aerasi dan filter. Sebelum ikan dimasukkan ke dalam media penelitian inti, ikan ditimbang terlebih dahulu sebagai data awal. Selama penelitian inti setiap unit perlakuan diberi aerasi dan dilakukan penyiponan sisa pakan dan feses yang mengendap di dasar akuarium. Selanjutnya ditambahkan air dengan konsentrasi yang sama. Sedangkan parameter yang diukur adalah: 1. Tingkat Kerja Osmotik/ Gradien Osmotik Tingkat kerja osmotik dihitung berdasarkan formula yang digunakan oleh Anggoro (1992). TKO = Osmolaritas darah benih ikan (mosm/lh 2 O) Osmolaritas media (mosm/lh 2 O) Pengukuran tingkat kerja osmotik ikan bandeng dilakukan sebanyak 2 kali yaitu pada awal dan akhir penelitian (lampiran 3). 2. Tingkat Konsumsi Oksigen (TKO) Tingkat konsumsi oksigen akan diukur dengan menghitung selisih oksigen terlarut pada awal dan akhir penelitian per satuan waktu. TKO diukur dengan menggunakan toples tertutup tidak berwarna volume 3 liter yang diisi air. Air yang digunakan adalah air yang telah diaerasi selama 1 hari sehingga jenuh oksigen. Selanjutnya 1 ekor ikan yang sebelumnya telah dipuasakan selama 1 hari ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam toples dan diukur DO awalnya. Setelah 1 jam, dihitung lagi DO akhirnya. Maka akan didapatkan tingkat konsumsi oksigen ikan tersebut dengan menggunakan rumus berikut: TKO = {(DO awal DO akhir)/w x t} x V
47 TKO : Tingkat konsumsi oksigen (mg O2/gr tubuh/jam) DO awal : Oksigen terlarut pada awal pengamatan (mg/l) DO akhir : Oksigen terlarut pada akhir pengamatan (mg/l) W : Berat ikan uji (gr) T : Periode pengamatan (jam) V : Volume air dalam respirometer (L) Pengukuran konsumsi oksigen pada setiap perlakuan dilakukan sebanyak 4 kali yaitu pada hari ke-0, 10, 20, dan hari ke-30. 3. Kondisi hematologi (Gambaran darah) Pengamatan dan pengukuran gambaran darah terdiri atas: a. Haemoglobin: metode yang digunakan metode sahli dengan sahlinometer (Wedemeyer dan Yasutake 1977). b. Hematokrit adalah perbandingan antara volume sel darah dengan total volume darah (Anderson and Siwichki 1993). c. Jumlah eritrosit Σ eritrosit = Σ sel terhitung x 104 sel/mm3 (Blaxhall dan Daisley 1973) d. Jumlah leukosit Σ Leukosit = Σ sel terhitung x 50 sel/mm3 (Blaxhall dan Daisley 1973) Pengukuran gambaran darah ikan dilakukan sebanyak 3 kali yaitu pada hari ke-0, 15 dan hari ke- 30 (Lampiran 4). 4. Histokimia Ikan bandeng yang telah dipaparkan pada penelitian inti dapat mengakumulasi merkuri dalam jaringan tubuhnya. Oleh karena itu dibuat histokimia untuk melihat deposit merkuri pada jaringan ikan. Masing-masing diambil satu ekor per unit penelitian untuk diambil sampel organ dalamnya yaitu insang dan hati pada akhir penelitian. Uji histokimia ini dilakukan menggunakan metode Histoteknik dengan penguat (Embedding material) paraffin (Kiernan, 1990) dan menggunakan pewarnaan logam berat (Lampiran 5).
48 5. Kadar glukosa darah Pemeriksaan kadar glukosa darah ikan dilakukan sebagai indikator stres sekunder akibat toksisitas Merkuri. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan sebanyak 3 kali yaitu pada hari ke-0, 15 dan hari ke- 30 (lampiran 6). Rumus yang digunakan adalah: ] [ [ ] [ GD ] AbsSp AbsSt [ GSt ] : Konsentrasi glukosa darah (mg/ml) : Absorbansi sampel : absorbansi standar : Konsentrasi glukosa standar (mg/ml) 6. Laju pertumbuhan (GR) Data laju pertumbuhan ikan uji diperoleh dengan melakukan pengambilan ikan uji pada awal dan akhir penelitian, kemudian ditimbang beratnya. Laju pertumbuhan harian ikan dianalisa dengan menggunakan rumus berdasarkan Effendie (1979): Wt t 1 x 100 Wo dengan: α = laju pertumbuhan bobot rerata harian (%) Wt = bobot rata-rata individu pada waktu t (g) Wo = bobot rata-rata individu pada waktu t0 (g) t = lama percobaan (hari) 7. Efisiensi pakan Efisiensi pakan dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut: EP = Efisiensi pakan (%) Bt = Biomasa mutlak ikan pada akhir percobaan (g) Bd = Biomasa mutlak ikan yang mati selama percobaan (g) B0 = Biomasa mutlak ikan pada awal percobaan (g) F = Jumlah pakan yang dikonsumsi oleh ikan selama percobaan (g) 8. Kadar merkuri dalam media dan ikan bandeng Pengukuran kadar merkuri dalam media dan akumulasinya did aging ikan dilakukan pada awal dan akhir penelitian dengan menggunakan metode AAS.
49 Untuk pengukuran kadar merkuri pada ikan diukur di daging ikan bandeng (Lampiran 7). 9. Kelangsungan hidup (SR) Ikan yang dipelihara diamati setiap hari. Apabila terdapat ikan yang mati segera dikeluarkan dari wadah uji, dicatat dan tidak dilakukan pergantian ikan yang mati tersebut. Tingkat kelulusan hidup ikan bandeng dihitung dengan rumus berikut: SR : Tingkat kelangsungan hidup (%) Nt : Jumlah ikan yang hidup pada waktu t No : Jumlah ikan yang hidup pada awal penelitian 10. Fisika kimia air Data kualitas air yang diukur adalah salinitas, suhu, DO, ph, alkalinitas, kesadahan dan TAN. Pengukuran kualitas air dilakukan setiap 7 hari sekali selama masa penelitian. Tabel 1. Metode dan alat untuk analisis parameter fisika kimia air Parameter Salinitas Suhu DO ph Alkalinitas Kesadahan TAN Satuan %0 0 C mg/l mg/l mg/l mg/l Alat Refraktometer Termometer ph meter DO meter Titrasi Titrasi Spektrofotometer Analisis Data Data parameter pengamatan pada perlakuan A dan B di uji menggunakan Uji T. Sedangkan data pengaruh perlakuan salinitas dan toksisitas merkuri terhadap perubahan gradien osmotik, tingkat konsumsi oksigen, kondisi hematologi, kadar glukosa darah, laju pertumbuhan, efisiensi pakan dan kelangsungan hidup ikna bandeng dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA) menggunakan SPSS 17. Apabila terdapat pengaruh nyata maka dilanjutkan dengan uji Tukey. Selanjutnya histokimia organ ikan dan data fisika kimia air akan dianalisa secara deskriptif dengan menggunakan tabel dan gambar.