18 METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan dari bulan April 2013 sampai dengan April 2014. Sampel diambil dari itik dan ayam dari tempat penampungan unggas, pasar unggas dan peternakan yang ada di 10 kecamatan di Kabupaten Subang yaitu Binong, Ciasem, Cipeundeuy, Cipunagara, Compreng, Pagaden, Pusaka Negara, Subang, Sukasari dan Tambak Dahan. Pengujian dilakukan di Bagian Mikrobiologi Medik Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesmavet, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor Alat dan Bahan Sampel usapan orofaring dan kloaka diambil menggunakan cotton swab steril. Media transport yang digunakan adalah brain heart infusion broth (BHIB) dalam microtube 2 ml, larutan phosphate buffered saline (PBS) ph 7.2, sel darah merah ayam 0.6% dan 1%, VND referensi (4 HAU) galur LaSota (koleksi FKH- IPB) dan antiserum spesifik terhadap ND yaitu galur LaSota dan Komarov digunakan untuk uji HI (koleksi BBPMSOH). Peralatan yang digunakan antara lain biosafety cabinet (BSC) (Nuaire dan Esco), mikropipet, tips, vortex dan alkohol. Pengambilan Sampel Usapan Orofaring dan Kloaka Cotton swab dimasukkan ke dalam orofaring sambil diusap dan diputarputar, lalu dipatahkan dan dimasukkan ke microtube 2 ml yang berisi media BHIB. Begitu juga dengan sampel usapan kloaka, terlebih dahulu daerah sekitar kloaka yang kotor dibersihkan dengan kapas yang sudah dibasahi alkohol 70%, lalu dengan cotton swab, kloaka diulas sambil diputar-putar kearah dorsal, kemudian dipatahkan dan dimasukkan ke microtube 2 ml yang berisi media. Setelah itu sampel dimasukkan ke dalam ice box dingin. Suhunya dijaga agar tetap dingin (4 8 C), sampai tiba di laboratorium untuk diuji. Serum Darah diambil pada masing-masing unggas yang telah diambil sampel usapannya. Sebanyak 2 ml darah diambil dari vena brachialis menggunakan syringe 3 ml, lalu didiamkan selama ± 30 menit pada suhu kamar, kemudian disimpan selama 24 jam di dalam lemari pendingin (4 C). Serum dipisahkan dari
endapan sel darah merah dan dipindahkan ke microtube 2 ml, selanjutnya disimpan pada freezer ( 20 C). 19 Penggabungan (Pooling) Sampel Penggabungan sampel usapan orofaring dan kloaka yang terdiri dari 5 7 individu per pool dilakukan berdasarkan jenis usapan, unggas, lokasi dan waktu pengambilan sampel. Sebanyak 100 µl sampel diambil dari tiap sampel individu dan dimasukkan ke dalam microtube 2 ml. Sampel pool selanjutnya digunakan untuk uji rrt-pcr menggunakan primer matrix (M). Isolasi RNA Isolasi RNA virus dilakukan sesuai prosedur standar QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen). Sebanyak 0.56 ml buffer AVL dimasukkan ke dalam microtube 1.5 ml, kemudian ditambahkan 0.14 ml sampel dan dihomogenkan dengan vortex selama 15 detik. Lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit dan disentrifugasi selama satu menit untuk menurunkan cairan yang menempel pada dinding tabung. Selanjutnya ditambahkan 0.56 ml ethanol, dihomogenkan dengan vortex selama 15 detik, lalu disentrifugasi selama 1 menit, kemudian larutan dipindahkan ke dalam QIAamp column dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Column dipindahkan ke dalam tabung koleksi yang baru dan ditambahkan 0.5 ml buffer AW1 ke dalam column, disentrifugasi 8000 rpm selama 1 menit dan column diletakkan ke dalam tabung koleksi yang baru. Sebanyak 0.5 ml buffer AW2 ditambahkan ke dalam column serta disentrifugasi kembali dengan kecepatan 8000 rpm selama 3 menit kemudian column diletakkan ke dalam tabung microtube 1.5 ml. Langkah akhir, ditambahkan 0.06 ml buffer AVE ke dalam column dan diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Hasil elusi RNA disimpan dalam microtube 1.5 ml pada suhu -20 C. Uji Real Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (rrt-pcr) Matrix (M) Protokol rrt-pcr yang digunakan adalah protokol National Veterinary Services Laboratories (NVSL) (2005). Pembuatan master mix dilakukan secara berurutan yaitu : RNAse-free dh 2 O 0.23 µl, buffer 2 12.50 µl, primer forward (20 µm) 0.5 µl, primer reverse (20 µm) 0.5 µl, probe (5 µm) 0.6 µl, detection enhancer 1.67 µl dan yang terakhir ditambahkan enzim mix 25 sebanyak 1 µl. Primer matrix (M) yang digunakan adalah matrix forward (M+4100), matrix reverse (M-4220) dan probe (M+4169). Penambahan reagen uji rrt-pcr dilakukan didalam biosafety cabinet (BSC) secara berikut : sebanyak 17 µl master mix (MM) dimasukkan ke dalam tabung optik, kemudian ditambahkan 8 µl RNA
20 template hasil isolasi. Tabung ditutup dengan seal optik dan kemudian dimasukkan ke mesin rrt-pcr Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System yang sudah diatur programnya sebagai berikut : (i) 1 (45 C, 10 menit), (ii) 1 (95 C, 10 menit), (iii) 40 (95 C, 10 menit; 56 C, 32 detik; 72 C, 10 detik). Hasil rrt-pcr dianalisis menggunakan Applied Biosystems 7500 Real time PCR System software version 1.4.0 Isolasi Virus Newcastle Disease dari Telur Ayam Berembrio (TAB) Specific Pathogen Free (SPF) Sampel usapan orofaring dan kloaka yang digunakan sebagai inokulum adalah sampel individu unggas dari pool positif rrt-pcr matrix (M). Sebanyak 0.2 ml inokulum mengandung penicillin-streptomycin (200.000 i.u.) diinkubasikan selama 30 menit pada suhu ruang (27 C) disuntikkan pada ruang alantois (allantoic cavity) TAB SPF. Telur kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 4 7 hari dan diobservasi 3 kali sehari untuk melihat viabilitasnya (OIE 2012). Isolat yang diperoleh dari cairan alantois dikonfirmasi kembali dengan rrt-pcr matrix (M). Uji Hemaglutinasi (HA) Prosedur uji HA yang dilakukan adalah metode mikro (OIE 2012). Sebanyak 25 µl PBS dimasukkan ke dalam plat mikro berdasar V pada sumuran 2 12 dari kolom A sampai kolom E. Pada sumuran 1, kolom A sampai F, dimasukkan 50 µl suspensi virus. Pengenceran virus kelipatan dua dilakukan dari sumuran 1 ke sumuran 2 (A E). Pada sumur 2B dilakukan pengenceran 1/3 kali dengan menambahkan 25 µl PBS, dihomogenkan dan dibuang sebanyak 25 µl. Pada sumur 2C dilakukan pengenceran 1/5 kali dengan menghomogenkan dan membuang 75 µl PBS, sumur 2D diencerkan 1/7 dengan menambahkan 127 µl PBS dan sumur 2E diencerkan 1/9 kali dengan menambahkan 175 µl PBS. Selanjutnya dilakukan pengenceran kelipatan dua dari sumuran ke-2 sampai ke sumuran ke-12. Sel darah merah 1% sebanyak 25 µl dimasukkan ke setiap sumuran. Kemudian digoyang menggunakan plat mikro shaker, didiamkan pada suhu ruang (25 27 C) selama 40 menit. Setelah itu diamati, hasil positif ditandai adanya aglutinasi sel darah merah seperti butiran pasir, dan negatif jika terlihat adanya aliran sel darah merah (running bottom/tear drop). Titer VND adalah pengenceran tertinggi yang masih dapat mengaglutinasi sel darah merah secara sempurna. Uji HA dilakukan pengulangan sebanyak 3. Uji Hambatan Hemaglutinasi (HI) Prosedur uji HI yang digunakan adalah metode mikro (OIE 2012). Uji HI yang digunakan adalah cara beta yakni menggunakan virus tetap (tidak diencerkan) sedangkan serum diencerkan. Phosphat buffer saline (PBS) dimasukkan 25 µl ke dalam tiap sumuran plat mikrotiter berdasar V, kemudian 25
µl serum standar dimasukkan pada kolom sumuran pertama. Pengenceran kelipatan dua dilakukan dari sumuran pertama sampai sumuran ke-12. Lalu ditambahkan cairan alantois yang mengandung virus 4 HAU ke setiap sumuran. Secara pelan digoyang dan plat diinkubasi pada suhu 4 o C selama 60 menit. Suspensi sel darah merah 1% ditambahkan sebanyak 25 µl ke semua sumuran dan dihomogenkan menggunakan mikroplate shaker dan diinkubasi pada suhu ruang (25 27 C) selama 40 menit. Setelah itu diamati, hasil positif ditandai adanya hambatan aglutinasi (running bottom/tear drop) sel darah merah, dan negatif jika terbentuk butiran seperti pasir. Titer HI ditentukan pada pengenceran serum tertinggi yang masih terjadi pengendapan (hambatan aglutinasi). Uji HI dilakukan pengulangan sebanyak 3. 21 Uji Real Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (rrt-pcr) Fusion (F) Protokol rrt-pcr yang digunakan mengikuti prosedur NVSL (2005). Pembuatan master mix dilakukan secara berurutan yaitu : RNAse-free dh 2 O 0.37 µl, buffer 2 12.50 µl, primer forward (20 µm) 0.67 µl, primer reverse (20 µm) 0.33 µl, probe (5 µm) 0.45 µl, detection enhancer 1.67 µl dan yang terakhir ditambahkan enzim mix 25 sebanyak 1 µl. Primer fusion (F) yang digunakan adalah fusion forward (F+4829), fusion reverse (F-4939) dan probe (F+4894). Setelah itu sebanyak 17 µl master mix (MM) dimasukan ke dalam tabung optik, kemudian ditambahkan 8 µl RNA template hasil isolasi. Tabung ditutup dengan seal optik dan kemudian dimasukkan ke mesin rrt-pcr Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System yang sudah diatur programnya sebagai berikut : (i) 1 (45 C, 10 menit), (ii) 1 (95 C, 10 menit), (iii) 40 (95 C, 10 menit; 56 C, 32 detik; 72 C, 10 detik). Hasil rrt-pcr dianalisis menggunakan Applied Biosystems 7500 Real time PCR System software version 1.4.0 Uji Waktu Elusi Prosedur uji dilakukan mengikuti metode Ezeibe dan Ndip (2005). Sebanyak 0.05 ml larutan PBS dimasukkan ke plat mikro pada sumuran 1 12, kemudian ditambahkan 0.05 ml suspensi virus pada sumuran 1 dan diencerkan kelipatan dua dari sumuran 1 11. Sebanyak 0.05 ml PBS ditambahkan ke sumuran 1 12, diikuti dengan 0.05 ml suspensi sel darah merah 0.6% dan dihomogenkan menggunakan shaker. Didiamkan pada suhu ruang (25 27 C) selama 40 menit, setelah terjadi hemaglutinasi, diamati lamanya waktu dari munculnya hemaglutinasi sempurna pada pengenceran tertinggi sampai terjadinya pengendapan sel darah merah kembali (elusi). Uji waktu elusi dilakukan pengulangan 3.
22 Analisis Data Data dianalisis secara deskriptif dan statistik untuk menentukan standard mean deviation (SD). Rataan titer antibodi dihitung menggunakan geometric mean titre (GMT) dengan rumus : Log2 GMT = ( Log2 t1 )( S1 ) + ( Log2 t1 )( S1 ) + + ( Log2 tn )( Sn ) N Keterangan : N = Jumlah contoh serum yang diamati t = Titer antibodi pada pengenceran tertinggi (yang masih dapat menghambat aglutinasi sel darah merah) S = Jumlah contoh serum yang bertiter t n = Titer antibodi pada sampel ke-n Koefisien variasi (coefisien variation/ CV) dari respon kekebalan dinyatakan dengan rumus: CV = S x 100% Keterangan : CV = koefisien variasi, S = simpangan standar, = rata-rata titer antibodi