AKTIVITAS PROTEOLITIK MIKROORGANISME LIMBAH PADAT PENGOLAHAN TAHU Askur Rahman dan Cahyo Indarto Jurusan Teknologi Industri Pertanian (TIP) email: s_coer_r@yahoo.com ABSTRAK Kebutuhan enzim protease terus meningkat sehingga terus diupayakan mencari sumber-sumber baru. Enzim protease dari mikroorganisme lebih visible karena pertumbuhan mikroorganisme sangat cepat dan mampu memproduksi enzim dalam jumlah banyak. Limbah padat pengolahan tahu banyak mengandung mikroorganisme pemecah protein, karena limbah tersebut masih mengandung protein. Oleh karena itu dalam usaha memproduksi enzim protease dari mikroorganisme limbah padat pengolahan tahu ini perlu dilakukan penelitian tentang: Pengayaan dan isolasi mikroorganisme penghasil enzim protease; Karakterisasi mikroorganisme limbah padat pengolahan tahu yang memproduksi enzim protease; Pencarian mikroorganisme terpilih berdasarkan kualitas dan kuantitas enzim protease yang dihasilkan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa: Terdapat 9 koloni mikroorganisme yang menunjukkan aktivitas protease; Didapatkan 2 jenis mikroorganisme yang memiliki aktivitas protease yang tinggi, yang diukur dengan luas zona bening yang terbentuk. yaitu mikroorganisme TM2 (diameter l9 mm) dan TM5 (diameter 3l mm); Masa pertumbuhan optimal dari mikroorganisme terpilih (TM5), adalah i 54 jam, dengan aktivitas protease mencapai 18,4 unit. PENDAHULUAN Kebutuhan enzim protease baik untuk industri pangan maupun industri non pangan yang belum terpenuhi, dan adanya kecenderungan peningkatan permintaan akan enzim protease dari tahun ketahun, mendorong para peneliti untuk berupaya menemukan alternatif sumber baru enzim protease. Dengan pertimbangan ekonomis dan pertimbangan kecepatan proses, mikrobia sebagai sumber enzim protease banyak digunakan dibandingkan sumber enzim protease dari hewan maupun tanaman (Shumi and Anwar 2004). Usaha-usaha untuk mendapatkan enzim protease dari mikroorganisme baru terus dilakukan, Shumi and Anwar (2004) memproduksi enzim dari Listeria sp. Isolasi bakteri yang menghasilkan enzim protease yang bekerja dalam lingkungan yang ekstrim yaitu dalarn suasana alkaline dan suhu tinggi dilakukan oleh Akhdiya (2003). Produksi enzim ekstraseluler dari bakteri Bacillus sp dilakukan oleh Olajuyigbe and Ajele (2005). Usaha memproduksi enzim dari mikroorganisme limbah juga telah dilakukan oleh berbagai peneliti sebelumnya, antara lain Paranthaman et al. (2009) Milala et al. (2005) 893
Seminar Nasional : Menggagas Kebangkitan memproduksi enzim dari mikroorganisme Aspergillus niger yang dikultivasi pada berbagai jenis limbah hasil pertanian. Kelebihan limbah padat pengolahan tahu sebagai media untuk pertumbuhan mikroorganisme penghasil enzim protease adalah dapat ditinjau dari dua hal, yaitu dari sisi ketersediaan bahan baku dan dari sisi aktivitas enzim proteasenya. Dari sisi ketersediaan bahan baku, limbah padat pengolahan tahu tersedia sangat berlimpah, karena di Indonesia terdapat puluhan ribu pengrajin tahu. Kelebihan lain dari limbah padat pengolahan tahu adalah bahwa mikroorggrtisme yang secara alami tumbuh pada limbah tersebut mempunyai aktivitas proteolitik yang tinggi (65.24 x l0-2 µmol tir.ml - l.min -1 bahkan melebihi aktivitas enzim bromelin yang diekstraksi dari nanas yang aktivitasnya hanya sebesar 55,24 x l0-2 mol tir.ml -1.min - (lndarto 2007). Umumnya enzim protease dari sumber baru atau medium pertumbuhan baru yang telah ditemukan oleh beberapa peneliti tidak populer dalam penggunaannya. Hal ini dikarenakan penelitian-penelitian tersebut dilaksanakan kebanyakan hanya menguji aktivitas enzim maupun langsung mengaplikasikannya dalam skala laboratorium, dan tidak didasari oleh data empiris tentang sifat-sifatnya maupun kondisi-kondisi optimum secara menyeluruh untuk aktivitas enzim protease yang ditemukan. Kondisi ini menyebabkan enzim baru tersebut belum aplikoble dan hanya sebatas kajian laboratorium. Demikian juga masih sedikit penelitian yang dilaksanakan secara tuntas dan mempelajari semua aspek yang mempengaruhi produksi enzim protease tersebut. Banyak hasil penelitian merupakan kajian terpisah satu sama lain, secara teknis masih banyak kendala untuk dapat mengembangkan enzim protease baru tersebut. Apalagi, Enzim adalah biokatalisator yang rapuh, dibandingkan dengan katalisator lain di bidang industri. Kerusakan enzim bisa disebabkan oleh faktor lingkungan seperti panas, ph, oksigen, kadar air maupun faktur internal yaitu terjadinya kerusakan konformasi protein maupun kerusakan sisi aktif enzim maupun aotulisis (Fox 2001). Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian tentang model optimalisasi yang dapat mempelajari berbagai faktor yang berpengaruh terhadap produksi enzim dari mikroorganisme, secara bersamaan dan tuntas. Sehingga mikroorganisme terpilih yang tumbuh dari media limbah tahu, benarbenar dapat diketahui sifat-sifatnya respon terhadap lingkungan dan upaya-upaya untuk meningkatkan produksinya. Dengan demikian, hasil penelitian ini diharapkan dapat memanfaatkan limbah padat pengolahan tahu yang sangat melimpah, sebagai media pertumbuhan mikroorganisme terpilih yang secara alami sudah ada pada limbah padat. Enzim protease mikroorganisme diproduksi dengan cara sebagai berikut: satu loop penuh kultur dari agar plate diinokulasikan ke dalam beaker glass 50 ml yang mengandung 5 ml medium, diinkubasikan selama 24 jam. Kultur ini selanjutnya diinokulasikan ke dalam beaker glass kapasitas 500 ml yang mengandung 100 ml medium dan diinkubasikan selama 48 jam. Sel-sel mikroorganisme dan material tidak 894
larut dipisahkan dengan sentrifugasi pada 10.000 g, l0 menit dengan suhu 4 o C. Supernatan digunakan sebagai enzim protease kasar yang selanjutnya diuji aktivitasnya. METODE PENELITIAN Pengayaan dan Isolasi Mikroorganisme Limbah Padat Pengolahan Tahu Pengayaan dan isolasi mikroorganisme penghasil enzim protease dari limbah tahu dilakukan dalam medium yang diperkaya dengan susu skim. Aliquot (100 µl) suspensi sampel ditumbuhkan dalam medium pada suhu kamar selama 3 hari. Medium mengandung agar, skim milk, yeast ekstrak, dan bahan bahan lain yang telah dioutoclave selama 20 menit pada suhu 121 o C. Pembentukan zona halo sekeliling koloni-koloni yang merupakan hasil dari hidrolisis casein menunjukkan adanya aktivitas bakteri pemecah protein atau menunjukkan adanya aktivitas bakteri yang menghasilkan enzim protease. Kolonikoloni ini selanjutnya diisolasi dan ditanam lagi dalam medium sampai didapatkan koloni yang seragam. Karakterisasi Mikroorganisme Yang Memproduksi Enzim Protease Koloni-koloni mikroorganisme yang menunjukkan adanya aktivitas pemecahan protein selanjutnya dilakukan screening lebih lanjut dengan medium yang mengandung agar, pepton, skim milk dan bahan-bahan lain. Selanjutnya dilakukan karakterisasi terhadap mikroorganisme-mikroorganisme yang diduga memiliki aktivitas proteolitik tinggi. Karakterisasi mikroorganisme dilakukan berdasarkan karakter morfologi dan karakter biokimia mikroorganisme. Karakter ini meliputi motility test, indole production, starch hidrolysis, spore test, urease activity, nitrate reduction test dan sebagainya. Mencari dan Menentukan Mikroorganisme Terpilih Penghasil Enzim Protease Terbaik Mikroorganisme terpilih ditentukan berdasarkan aktivitas proteolitik dari enzim yang dihasilkan mikroorganisme tersebut. Mikroorganisme yang menghasilkan aktivitas proteolitik tertinggi ditentukan sebagai mikroorganisme terpilih. Mikroorganisme yang memiliki aktivitas proteolitik tinggi dicirikan dengan semakin luasnya zona halo yang dapat di amati setelah masa inkubasi. Masa inkubasi pada tahap penelitian inii adalah 24 jam pada suhu 37 o C± 1. Pengukuran aktivitas proteolitik dilakukan berdasarkan metode Leewit dan pornsuksawang (1988). Enzim protease mikroorganisme diproduksi dengan cara sebagai berikut: satu loop penuh kultur dari agar plate diinokulasikan ke dalam beaker glass 50 ml yang mengandung 5 ml medium, diinkubasikan selama 24 jam. Kultur ini selanjutnya diinokulasikan ke dalam beaker glass kapasitas 500 ml yang mengandung 100 ml medium dan diinkubasikan selama 48 jam. Sel-sel mikrroorganisme dan material tidak 895
Seminar Nasional : Menggagas Kebangkitan larut dipisahkan dengan sentrifugasi pada 10.000 g, 10 menit dengan suhu 4 o C. Supernatan digunakan sebagai enzim protease kasar yang selanjutnya diuji aktivitasnya. Pengujian Aktivitas Protease (Leewit dan Pornsuksawang 1988) Pengujian aktivitas enzim protease menggunakan substrat kasein 1,5% 3 ml kasein ditambahkan 10 μl enzim dan diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 40 selama 20 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 1 ml asam trikloro asetat (TCA). Endapan dibuang dan supernatan disaring dengan kertas saring Whatman nomor 42. asam amino dan peptida terlarut hasil hidrolisa kasein oleh enzim protease diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV Shimadzu 160 A pada panjang gelombang 280 nm (Anderson et al., 1995). Aktivitas enzim protease dinyatakan dalam mikromol tirosin yang dihasilkan dari hidrolisa substrat per ml per menit. (μmol tir.ml -1.min -1 ). HASIL DAN PEMBAHASAN Pegayaaan dan Isolasi Mikroorganisme Hasil penelitian menunjukkan bahwa mikroorganisme yang diisolasi dari limbah padat pengolahan tahu, setelah di tumbuhkan dalam media agar, menghasilkan 9 (sembilan) koloni yang dapat diidentifikasi. Sembilan koloni tersebut di beri kode sebagai berikut : Tabel l. Isolat mikroorganisme hasil pengayaan dari limbah padat tahu Kode Morfologis Pembentukan Halo TM1 Tidak Bermiselia + TM2 Tidak Bermiselia +++ TM Tidak Bermiselia + TM Tidak Bermiselia + TM Tidak Bermiselia +++++ TM Tidak Bermiselia ++ M Bermiselia ++ M Bermiselia + M Bermiselia + Zona bening yang terbentuk pada substrat mengindikasikan adanya aktivitas protease oleh mikroorganisme yang tumbuh pada medium tersebut (Olajuyigbe dan Ajele 2008). Semakin luas zona bening yang terbentuk mengindikasikan semakin tinggi kemampuan mikroorganisme dalam memecah protein substrat, dan sebaliknya semakin sempit zona halo yang terbentuk mengindikasikan semakin rendah kemampuan mikroorganisme dalam mendegradasi protein substrat yang artinya semakin sedikit kemampuan mikroorganisme tersebut dalam mernproduksi enzim protease pemecah protein. Hasil dari penelitian yang dilakukan, terhadap limbah pada pengolahan tahu yang di tumbuhkan dalam media yang diperkaya dengan susu skim menghasilkan 9 jeniskoloni seperti yang tercantum dalam Tabel l. Koloni dengan kode TMI sampai 896
dengan TM6 memiliki ciri tidak bermiselia, sedangkan Ml sampai dengan M3 adalah koloni mikroorganisme yang menghasilkan miselia. Sedangkan Wngamatan visual terhadap luas zona bening yang terbentuk di sekitar koloni di dapatkan hasil bahwa mikroorganisme yang memiliki luas zona bening tinggi adalah mikroorganisme dengan kode TM2 dan TM5. Berikut ini gambar koloni mikrooiganisme yang tumbuh dalam pada substrat yang mengandung skim milk. Gambar 1. Koloni Mikrooiganisme yang Tumbuh pada Substrat Karakteristik Mikroorganisme Plated out lebih lanjut dengan media Skim, peptone agar, mikroorganisme TM2 dan TM5 menunjukkan kemampuan yang sangat berbeda dalam menghidrolisis protein substrat. Cambar l, menunjukkan perbedaan kemampuan TM2 dan TM5 dalam menghidrolisa protein substrat. Dengan membandingkan zona bening lang dihasilkan dalam pengujian ini menunjukkan bahwa TM5 (Gambar 2 bagian atas) memiliki kemampuan melakukan pemecahan protein yang lebih tinggi dari pada Mikroorganisme TM2 (Gambar 2 bagian bawah) dapat di pilih koloni-koloni yang memiliki halo yang luas. Gambar 2. Perbandingan zona bening yang terbentuk dari 2 koloni berbeda dari mikroorganisme limbah padat pengolahan tahu (TM5 kanan. dan TM2 kiri) 897
Seminar Nasional : Menggagas Kebangkitan Pengukuran luas zona yang terbentuk dapat dilakukan dengan cara sederhana dengan menghitung luas lingkaran ataupun mengitung diameter dari zona bening. Hasil pengukuran diameter zona bening dari mikroorganisme TM2 dan TM 5 dengan ulangan 3 kali di tampilkan pada tabel 2 berikut ini. Tabel 2. Diameter zona bening dari 2 koloni mikroorganisme yang berbeda lsolat/koloni Diameter Diameter Diameter Rerata (mm) (mm) Ulangan I (mm) Ulangan I (mm) Ulangan I TM5 28 35 30 31 TM2 21 16 20 19 Berdasarkan parameter pengamatan di atas maka TM5 digunakan sebagai mikroorganisme terpilih yang di di amati ciri ciri morfologinya dan dilakukan test biokomia sederhana. Berdasarkan pengamatan morfologi maka, koloni mikroorganisme TM5 memiliki ciri ciri morfologi sebagai berikut : 1. Koloni melekat erat pada medium 2. Koloni berbentuk cenderung membentuk lingkaran dengan tepi luar bercabang 3. Warna koloni putih kekuningan 4. Bentuk koloni cembung 5. Pada umur 72 jam, koloni menjadi kasar. Pengamatan karakteristik biokimia terhadap mikroorganisme TM5, dilakukan untuk mengetahui respon mikroorganisme terhadap lingkungannya maupun terhadap perlakuan yang di aplikasikan pada mikroorganisme tersebut. Respon biokimia tersebut dapat di gunakan untuk melengkapi karakterisasi lebih lanjut. Tabel 3, menyajikan beberapa uji biokimia terhadap mikroorganisme TM5. Tabel 3. Karakter biokimia mikroorganisme isolate TM5 Tes Karakteristik Produksi H 2 S Tes katalase Hidrolisa gelatin Tes Indole Negatif NaCl 1% NaCl 2% Hidrolisa pati Negatif Koloni agar Putih kekuningan, berbentuk lingkaran, permukaan halus Aktivitas Proteolitik Tertinggi Mikroorganisme Terpilih Mikroorganisme terpilih (TM5) dltentukan berdasarkan aktivitas proteolitik dari enzim yang dihasilkan mikoorganisme tersebut. Pengamatan terhadap aktivitas proteasemikroorganisme (TM5) juga dilakukan pada masa inkubasi yang berbeda beda, 898
pengamatan aktivitas protease pada berbagai maa inkubasi yang berbeda ini dimaksudkan untuk mencari waktu optimal pertumbuhan mikroorganisme yang menghasilkan aktivitas protease tertinggi. Pengamatan aktivitas protease dilakukan pada selang waktu 6 jam masa inkubasi. Mikrooganisme yang di tumbuhkan dalam madia di amati setiap 6 jam sekali. Isolate TM5 di tumbuhkan dalam media dengan suhu 37 o C, pada shaking inkubator. Setiap akhir masa pengamatan (jam ke 0, 6, 12, 18, 24,30, 36, 42,48, 54 dan 60) dilakukan pengambilan supematan dari media yang kemudian di ukur aktivitas proteolitiknya. Produksi enzim protease meningkat sangat tajam pada saat awal pertumbuhan mikroorganisme. Aktivitas enzim sebesar 0,8 unit, pada jam ke 6 dan meningkat menjadi I8.4 unit pada jarl ke 54. Peningkatan ini bersamaan dengan pertumbuhan jumlah mikroorganisme penghasil enzim protease tersebut. Setelah masa pertumbuhan 54 jam, aktivitas enzim protease menunjukkan kecenderungan konstan, sampai dengan jam ke 60 dengan aktivitas protease sebesar 17,8 unit. Puncak produksi enzim yang terjadi pada jam ke 54 menunjukkan bahwa mikroorganisme tumbuh secara optimal dalam menghasilkan enzim pada lama masa pertumbuhan 54 jam. Informasi ini sangat berguna untuk menentukan masa panen biomassa atau enzim protease pada saat mikroorganisme menghasilkan enzim protease secara maksimal, yaitu pada masa pertumbuhan atau masa inkubasi 54 jam. Hasil penelitian ini berbeda dengan penelitian yang dilakukan Jayasree et al. (2009) yang rneneliti aktivitas protease pada mikroorganisme Streptomyces pulvereceus, dimana aktivitas protease maksimal terjadi pada lama masa pertumbuhan 96 jam. Peneliti yang lain, Olajuyigbe and Ajele (2008), melaporkan bahwa aktivitas enzim protease l0 mikroorganisme yang condiment, mencapai diisolasi dari "iru", a traditionally fermented African Locust puncakya pada masa pertumbuhan 42 jam. Waktu tumbuh (jam) Gambar 3. Kinetika produksi protease yang dinyatakan dalam satuan unit 899
Seminar Nasional : Menggagas Kebangkitan Aktivitas enzime protease meningkat selama masa pertumbuhan awal, dan menunjukkan kecenderungan konstan setelah masa pertumbuhan 42 jam. Pada saat awal pertumbuhan aktivitas enzim masih rendah, di duga karena terjadinya represi katabolit. Menurut Priest dalam Akhdiya (2003) selama pertumbuhan awal mikroorganisme, pertumbuhan sel mengikuti pola eksponensial yang memerlukan energi yang sangat besar untuk pertumbuhan tersebut mengakibatkan sel mengalami represi katabolit yang menyebabkan sintesis eksoenzimnya terhambat. Pada fase statis, represi katabolit terangkat sehingga biosintesa eksoenzim menjadi meningkat. KESIMPULAN 1) Terdapat 9 koloni mikroorganisme yang ditemukan pada limbah padat pengolahan tahu yang menunjukkan aktivitas protease dengan indikasi menghasilkan zona bening ketika ditumbuhkan dalam medium yang diperkaya dengan skim milk 2) Hasil screening lebih ldut di dapatkan 2 jenis mikroorganisme yang memiliki aktivitas protease yang tinggi, yang diukur dengan luas zona bening yang terbentuk, yaitu mikroorganisme TM2 (diameter l9 mm) dan TM5 (diameter 3l mm). Mikroorganisme ini memiliki karakteristik tes katalase positif, hidrolisa gelatin positif tes, indole negatif, hidrolisa pati, NaCl l% dan 2% positif, koloni berbentuk lingkaran, wama putih kekuningan dengan permukaan halus. 3) Masa inkubasi optimal dari mikroorganisme terpilih (TM5), adalah pada saat masa pertumbuhan atau inkubasi 54 jam. Pada masa inkubasi 54 jam aktivitas protease mencapai 18.4 unit. DAFTAR PUSTAKA Akhdiya A. 2003. Isolasi bakteri penghasil enzim protease alkalin termostabil. Buletin Plasma Nutfah 9 (2): - Fox PF. 2001. Food Enzymology. New York: Elservier Applied Science. New York. Indarto C. 2007. Aktivitas Protease Limbah Pengolahan Tahu. Bangkalan: Universitas Trunojoyo Madura. Jayasree D, Kumari K, Laksmi N. 2009. Optimization of Production Protocol of Alkaline Protease By Streptomyces pulvereceus. Journal of Science and Technology 1: - Leewit S, Pornskawng P. 1988. Protease from bacteria in soybean whey. Proc. Food Science and Technology in Industrial Development. Vol l. (Ed Manepon) pp. 751-754. Thailand. 900
Milala M, Shugaba A, Gilado E, Wafar JA. 2005. Studies on agricultural wastes for cellulase enzyme production by Aspergillus niger. Journal of Agriculture and Biological Science l (4): - Olajuyigbe FM, Ajele O. 2005. Production dynamic of extracellular protease from Bacillus species. African Journal 4 (8): - Paranthaman R., Alogusandaram I. 2009. Production of protease from rice mill waste by Aspergilltts sp. Journal of Agricultural Science 5 (3): - Shumi W, Anwar MN. 2004. Production of protease from Listeria monocytogenes. International Journal of Agriculture and Biology VI (6): - 901