HASIL DAN PEMBAHASAN

13 HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi dan Fraksinasi Sampel buah mahkota dewa yang digunakan pada penelitian ini diperoleh dari kebun percobaan Pusat Studi Biofarmaka, Institut Pertanian Bogor dalam bentuk simplisia yang kemudian dijadikan serbuk dengan ukuran 80 mesh. Kadar air serbuk mahkota dewa yang diperoleh sebesar 2.12%. Kadar air yang diperoleh kurang dari 10% merupakan kadar air yang baik karena pada tingkat kadar air tersebut waktu simpan sampel akan relatif lebih lama dan terhindar dari pencemaran yang disebabkan oleh mikroba dan memenuhi syarat sebagai bahan baku herbal (Winarno 1992; BPOM 2004). Ekstraksi serbuk buah mahkota dewa sebanyak 200 g dilakukan dengan cara refluks menggunakan pelarut metanol, disaring dan diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 30 o C. Ekstrak pekat yang diperoleh sebanyak 39.0776 g dengan rendemen 20.85%. Selanjutnya ekstrak metanol yang diperoleh dipartisi menggunakan kloroform. Hasil partisi dengan kloroform diperoleh fraksi metanol dengan rendemen 72.25% dan fraksi kloroform 24.98% dari ekstrak kasar metanol. Untuk mengetahui kandungan kimia dari fraksi metanol dan fraksi kloroform dilakukan uji fitokimia antara lain uji flavonoid, triterpenoid, steroid dan uji fenol. Hasil pengujian fitokimia fraksi metanol dan fraksi kloroform buah mahkota dewa dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2 Hasil uji fitokimia fraksi metanol dan fraksi kloroform buah mahkota dewa Golongan Senyawa Fraksi Metanol Fraksi Kloroform Fenol +++ ++ Flavonoid ++++ ++ Benzofenon +++ ++ Steroid +++ ++ Triterpenoid + +++ Keterangan : (+) : terdeteksi, semakin banyak (+) intensitas warna semakin meningkat

14 Hasil uji fitokimia pada Tabel 2 menunjukkan bahwa pada fraksi metanol golongan triterpenoid memperlihatkan warna ungu yang tidak terlalu kuat, sedangkan pada fraksi kloroform warna ungu terlihat pekat sehingga diduga triterpenoid terpisahkan pada partisi dengan kloroform. Sementara itu steroid pada kedua fraksi baik fraksi metanol maupun kloroform menunjukkan intensitas warna hijau yang kuat, yang menunjukkan keberadaan golongan steroid. Flavonoid pada fraksi metanol lebih kuat intensitas warnanya dibanding pada fraksi kloroform, hal itu terlihat dari warna merah yang kuat pada lapisan amil alkohol dari fraksi metanol. Pada uji fenol, fraksi metanol menunjukkan intensitas warna hijau yang lebih kuat dibanding fraksi kloroform. Oleh karena itu pada penelitian ini tujuan utamanya adalah untuk memperoleh golongan benzofenon yang merupakan bagian dari fenol, maka fraksinasi selanjutnya dilakukan pada fraksi metanol. Pencarian eluen terbaik untuk penggabungan fraksi hasil kromatografi kolom menggunakan pelat kromatografi lapis tipis (KLT), fraksi yang memiliki nilai R f yang sama atau hampir sama akan digabung. Pencarian eluen dimulai dari eluen tunggal yaitu metanol, etil asetat, kloroform, aseton, butanol, diklorometana, dan nheksana. Eluen tunggal yang dipilih adalah etil asetat (semipolar) dan metanol (polar) sebagai eluen tunggal terbaik karena noda yang terbentuk cukup banyak dan terpisah. Selanjutnya dilakukan penggabungan 2 eluen terbaik etil asetat:metanol dengan perbandingan 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9. Penggabungan 2 eluen belum diperoleh noda yang terpisah dengan baik (Lampiran 2), maka dilakukan penggabungan 3 eluen dengan menambahkan n heksana yang merupakan eluen nonpolar. Hasil penggabungan 3 eluen dengan berbagai perbandingan diperoleh eluen terbaik yaitu campuran nheksana:etil asetat:metanol (7:14:3) seperti ditunjukkan pada Gambar 3.

15 Gambar 3 Pola KLT eluen terbaik eluen nheksana:etil asetat: metanol (7:14:3) Fraksinasi dilakukan untuk memurnikan fraksi metanol sehingga diperoleh senyawa golongan benzofenon yang bersifat sitotoksik melalui uji toksisitas Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Fraksinasi dilakukan menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam silika gel dengan metode step gradient (peningkatan kepolaran) dimulai dari eluen nheksana, etil asetat, dan metanol. Tujuan peningkatan polaritas sistem eluen agar semua komponen yang terlarut dalam fraksi metanol akan terbawa lebih cepat dan pemisahan dapat berlangsung dengan baik. Fraksinasi yang dilakukan terhadap fraksi metanol menghasilkan 167 tabung yang digabung berdasarkan pola KLT dengan eluen campuran n heksana:etil asetat:metanol (7:14:3) sehingga diperoleh 12 fraksi (fraksi 112) seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4. Harga R f dan jumlah spot masingmasing fraksi dapat dilihat pada Lampiran 3.

16 E F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 Gambar 4 Pola KLT penggabungan fraksi hasil kromatografi kolom dengan eluen terbaik eluen nheksana:etil asetat: metanol (7:14:3) Uji Toksisitas Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Fraksi Hasil Kromatografi Kolom Uji toksisitas dilakukan pada fraksi 412 yang diduga mengandung senyawa golongan benzofenon. Terhadap fraksi 13 tidak dilakukan uji toksisitas karena diduga kuat tidak terdapat senyawa golongan benzofenon yang bersifat polar, sementara itu fraksi 13 diduga merupakan kelompok senyawa nonpolar karena fraksi 13 diperoleh setelah dielusi dengan eluen nonpolar. Nilai LC 50 fraksi 412 dapat dilihat pada Tabel 3. Dari hasil uji toksisitas BSLT (Tabel 3) diperoleh 3 fraksi terbaik yang memiliki toksisitas yaitu fraksi 4, 10, dan 11. Contoh perhitungan nilai LC 50 dapat dilihat pada Lampiran 4. Fraksi 4 merupakan yang paling baik dengan nilai LC 50 yang paling rendah. Hasil yang diperoleh lebih tidak aktif dibandingkan penelitian yang dilakukan oleh Lisdawati

17 (2002) terhadap ekstrak kasar metanol mahkota dewa (LC 50 berkisar antara 0.161511.8351 μg/ml). Diduga hal tersebut disebabkan oleh perbedaan lokasi tanam, iklim, dan waktu simpan yang membuat kandungan metabolit sekundernya berbeda. Tabel 3 Toksisitas BSLT fraksi hasil kolom (fraksi 412) fraksi metanol buah mahkota dewa Fraksi Nilai LC 50 (μg/ml) F4 30.90 F5 >1000 F6 >1000 F7 >1000 F8 >1000 F9 >1000 F10 588.57 F11 814.19 F12 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Fraksinasi golongan senyawa benzofenon pada fraksi 4 dilakukan dengan menggunakan KLTP. Sebelum dilakukan pemurnian menggunakan KLTP terhadap fraksi 4 sebagai fraksi paling sitotoksik pada uji BSLT, terlebih dahulu dilakukan pencarian eluen terbaik, karena eluen yang digunakan pada penggabungan fraksifraksi hasil kolom belum diperoleh spot yang terpisah dengan baik. Hasil pencarian eluen menggunakan eluen campuran antara kloroform:metanol:air dengan berbagai perbandingan dan studi literatur, diperoleh eluen campuran antara kloroform:metanol:air dengan perbandingan 70:20:2. Eluen ini untuk selanjutnya digunakan pada KLTP, hasilnya ditunjukkan pada Gambar 5.

18 Gambar 5 Pola KLT preparatif fraksi 4 hasil kromatografi kolom, eluen kloroform:metanol:air (70:20:2) Proses pemurnian fraksi 4 dengan KLTP menggunakan adsorben silika gel. Berdasarkan pemisahan yang dilakukan diperoleh 8 fraksi (fraksi 4 1 4 8 ). Noda yang terbentuk dapat dilihat dari pola KLT fraksi 4 hasil KLTP pada Gambar 6. Nilai R f ke8 fraksi hasil KLTP ini dapat dilihat pada Lampiran 5. F4 F4 1 F4 2 F4 3 F 4 4 F 4 5 F 4 6 F 4 7 F4 8 Gambar 6 Pola KLT hasil KLTP fraksi 4 dengan eluen kloroform:metanol:air (70:20:2)

19 Toksisitas Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Fraksi Hasil Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Hasil fraksinasi menggunakan KLTP ini diuji toksisitas BSLTnya untuk mendapatkan fraksi yang berpotensi sitotoksik. Adapun hasil pengujian aktivitas toksisitas BSLT terhadap 8 fraksi KLTP yang diperoleh ditunjukkan pada Tabel 4. Tabel 4. Toksisitas BSLT fraksi hasil KLTP (fraksi4 1 4 8 ) Fraksi hasil Nilai LC 50 (μg/ml) KLTP F4 1 >1000 F4 2 >1000 F4 3 >1000 F4 4 >1000 F4 5 899.28 F4 6 >1000 F4 7 100.00 F4 8 >1000 Data pada Tabel 4 menunjukkan bahwa fraksi hasil KLTP yang memiliki potensi sitotoksik yang paling baik dengan nilai LC 50 paling rendah adalah fraksi 4 7 dengan nilai LC 50 100 μg/ml, akan tetapi nilai ini tidak sebaik nilai LC 50 fraksi 4 hasil kromatografi kolom yaitu sebesar 30.90 μg/ml. Hal ini diduga karena komponen aktif tidak terpisah dengan baik pada KLTP atau disebabkan oleh komponen yang bekerja secara sinergis pada fraksi 4 menjadi berkurang setelah difraksinasi menggunakan KLTP. Sementara itu fraksi 4 5 menunjukkan nilai LC 50 di bawah 1000 μg/ml, yaitu 899.28 μg/ml, yang berpotensi sitotoksik. Keberadaan Golongan Benzofenon pada Fraksi Hasil Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Uji kualitatif golongan benzofenon dilakukan terhadap fraksifraksi hasil kromatografi kolom dan KLTP yang telah diuji toksisitas BSLTnya. Uji kualitatif ini dilakukan untuk mengetahui senyawa yang bersifat sitotoksik termasuk senyawa golongan benzofenon. Uji kualitatif fraksi hasil kolom, yaitu fraksi 412 dan fraksi hasil KLTP, yaitu fraksi 4 1 4 8. Uji kualitatif dilakukan dengan cara menyemprotkan reagen pendeteksi senyawa benzofenon Fast Blue Salt B 1%

20 dalam metanol air 1:1 pada plat KLT yang telah dielusi dengan eluen terbaik yaitu campuran kloroform:metanol:air (70:20:2). Hasil uji kualitatif fraksifraksi hasil kolom ditunjukkan pada Gambar 7. E F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 Gambar 7 Pola KLT uji kualitatif fraksi hasil kolom dengan eluen kloroform:metanol:air (70:20:2) Hasil uji kualitatif diperoleh beberapa fraksi yang diduga positif mengandung benzofenon yaitu fraksi 4, 5, 6, 10, dan 11. Hal ini terlihat dari perubahan warna spot pada plat KLT menjadi merah ungu terang sesaat setelah disemprot dengan reagen pendeteksi dan merah kecoklatan setelah teroksidasi. Pada fraksi 4 dengan R f 0,37 warna merah ungu sangat kontras, pada fraksi 5 terdapat 2 spot yang positif benzofenon yaitu pada spot ke5 dengan R f 0,37 warna merah ungu juga sangat kontras dan pada spot ke4 dengan R f 0.30. Jumlah spot dan harga R f masingmasing fraksi yang diduga mengandung benzofenon ditunjukkan pada Tabel 5.

21 Tabel 5 Jumlah spot dan nilai R f dari fraksi yang diduga positif mengandung senyawa benzofenon Fraksi hasil kolom Jumlah spot Nilai R f 4 1 0.37 5 2 0.30;0.37 6 2 0.15;0,37 10 3 0.15;0.30;0.37 11 2 0.30;0.37 Selanjutnya dilakukan uji kualitatif terhadap fraksi hasil KLTP yaitu fraksi 4 1 4 8 melalui cara yang sama dengan yang dilakukan pada fraksifraksi hasil kromatografi kolom. Hasil uji kualitatif fraksi hasil KLTP ditunjukkan pada Gambar 8. F4 F4 1 F4 2 F4 3 F4 4 F4 5 F4 6 F4 7 F4 8 Gambar 8 Pola KLT uji kualitatif fraksi 4 hasil KLTP dengan eluen kloroform:metanol:air (70:20:2). Dari hasil uji kualitatif fraksi hasil KLTP diperoleh fraksi 4 4 dan 4 5 yang diduga positif mengandung senyawa benzofenon. Pada fraksi 4 5 spot dengan nilai R f 0.37 warnanya terlihat sangat kontras dibanding fraksi 4 4 yaitu merah ungu setelah disemprot menggunakan Fast Blue Salt B dan menjadi coklat kemerahan setelah teroksidasi. Sementara itu fraksi 4 4 pada uji toksisitas BSLT tidak menunjukkan aktivitas yang baik, fraksi 4 5 menunjukkan aktivitas yang cukup baik walaupun tidak sebaik aktivitas fraksi 4 7, tetapi pada uji kualitatif fraksi 4 7 tidak terdeteksi mengandung senyawa benzofenon. Sementara itu dari hasil uji toksisitas BSLT fraksi 4 7 merupakan fraksi yang paling aktif, berwarna coklat tua

22 dan memiliki potensi sitotoksik terbaik dibanding fraksi hasil KLTP lainnya, diduga fraksi 4 7 merupakan senyawa turunan fenolat lain. Untuk mengidentifikasi golongan senyawa dideteksi menggunakan spektrofotometer UVVis dan IR. Rangkuman hasil fraksinasi, uji toksisitas dan uji kualitatif yang telah dilakukan selengkapnya ditunjukkan pada Tabel 6. Tabel 6 Hasil fraksinasi kromatografi kolom dan KLTP, toksisitas BSLT dan keberadaan benzofenon Fraksi hasil kolom Jumlah spot total Rendemen (%) LC 50 BSLT (µg/ml) Uji Kualitatif Benzofenon 4 8 14.63 30.90 ++ 5 9 7.69 ++ 6 10 12.50 ++ 7 8 12.19 8 4 1.71 9 3 1.67 10 10 6.17 588.57 ++ 11 7 7.40 814.19 + 12 3 7.20 Fraksi hasil KLTP 4 1 4 2 4 3 4 4 4 5 4 6 4 7 4 8 1 2 5 2 3 3 2 3 0.58 0.68 0.72 0.84 2.80 1.08 1.20 0.80 899.28 100.00 + ++ Keterangan : pada uji kualitatif : (): tidak terdeteksi; (+): intensitas warna cukup kuat; (++): intensitas warna kuat; pada LC 50 : (): tidak toksik Dari data pada Tabel 6 terlihat bahwa fraksi 4 hasil kolom dari fraksi metanol selain memiliki rendemen terbanyak, juga paling toksik pada uji BSLT dan positif mengandung benzofenon pada uji kualitatif. Dari data tersebut diduga bahwa pada fraksi 4 yang bersifat sitotoksik adalah senyawa benzofenon. Sementara itu fraksi 4 7 hasil KLTP yang tidak terdeteksi mengandung benzofenon dari uji BSLT ternyata memiliki toksisitas yang tinggi, sedangkan fraksi 4 5 yang terdeteksi mengandung benzofenon memiliki toksisitas yang rendah, hal ini

23 diduga pada fraksinasi menggunakan KLTP senyawa aktif belum terpisah dengan baik sehingga efek toksisitasnya menurun. Fraksi 4 7 merupakan fraksi hasil pemisahan dari fraksi metanol yang pada uji fitokimia terdeteksi memiliki kandungan flavonoid yang tinggi sehingga diduga senyawa yang bersifat sitotoksik pada fraksi 4 7 merupakan senyawa golongan flavonoid. Untuk mengetahui golongan senyawa dari fraksi 4 5 dan 4 7 maka dilakukan identifikasi menggunakan spektrofotometer UVVis dan IR. Analisis Spektrofotometer UVVis Fraksi Hasil KLTP Fraksi 4 5 hasil KLTP yang dari uji kualitatif diduga merupakan senyawa golongan benzofenon dianalisis menggunakan spektrofotometer UVVis. Hasil analisis menunjukkan fraksi 4 5 memiliki panjang gelombang maksimum (λ max ) dalam MeOH pada 200 nm dan serapan lainnya pada 264 nm (Gambar 9). Gambar 9 Spektrum UVVis Fraksi 4 5 hasil KLTP Serapan pada panjang gelombang maksimum 200 nm dan 264 nm menunjukkan adanya transisi elektron dari π ke π* yang merupakan ciri khas untuk sistem ikatan rangkap terkonjugasi dari suatu cincin aromatik yaitu kromofor C=C aromatik dan C=O. Cariphenone B yang berhasil diisolasi oleh Bernardi et al. (2004) dari Hypericum carinatum merupakan senyawa turunan benzofenon memiliki λ max 216, 254 dan 294 nm. Serapan fraksi 4 5 hasil KLTP

24 berada pada kisaran panjang gelombang senyawa benzofenon yang telah dilaporkan oleh Bernardi et al. (2004). Sementara itu pada fraksi 4 7 hasil KLTP yang pada uji kualitatif tidak mengandung senyawa benzofenon, tetapi melalui uji sitotoksik BSLT memiliki nilai LC 50 paling rendah, memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 249 dan 341 nm (Gambar 10), menurut Markham (1988) kisaran panjang gelombang 250280 nm dan 310350 nm tergolong flavonoid yaitu jenis flavon, λ maks 250270 nm menurut Harborne (1982) merupakan golongan flavon. Gambar 10 Spektrum UVVis Fraksi 4 7 hasil KLTP Analisis Spektrofotometer IR Fraksi Hasil KLTP Analisis spektrum IR fraksi 4 5 hasil KLTP (Gambar 11) menunjukkan uluran pada bilangan gelombang 3399, 2922, 1919, 1618, 1511, dan 1436 cm 1. Vibrasi regang pada bilangan gelombang 3399 cm 1 dengan bentuk pita lebar menunjukkan adanya gugus OH, vibrasi regang pada 2922 cm 1 menunjukkan grup CH jenuh atau metil (CH 3 ), serapan pada bilangan gelombang 1618 cm 1 secara kuat mengindikasikan keberadaan α β C=O tak jenuh dan vibrasi regang pada 1511 dan 1436 cm 1 mengindikasikan keberadaan cincin aromatik.

25 Gambar 11 Spektrum IR fraksi 4 5 hasil KLTP Sementara itu analisis spektrum fraksi 4 7 (Gambar 12) hasil KLTP terdapat uluran pada bilangan gelombang 3399, 2927, 2855, 1706, 1609, 1469, 1283 cm 1 dimana pada bilangan gelombang 3399 cm 1 menunjukkan gugus OH, 2927 dan 2852 cm 1 menunjukkan gugus CH 2, vibrasi regang pada bilangan gelombang 1706 cm 1 menandakan adanya gugus karbonil. Sedangkan pada bilangan gelombang 1609 dan 1465 cm 1 mengindikasikan keberadaan cincin aromatik. Dari data UVVis dan IR fraksi 4 7 diduga merupakan golongan flavonoid yaitu flavon. Gambar 12. Spektrum IR fraksi 4 7 hasil KLTP

26 Berdasarkan dugaan gugus fungsi yang didapatkan, terbukti adanya senyawa golongan benzofenon pada fraksi 4 5 hasil kltp dan golongan flavonoid yaitu flavon pada fraksi 4 7 hasil KLTP yang dapat dilihat pada Tabel 7. Tabel 7 Absorpsi IR gugusgugus fungsi fraksi 4 5 dan 4 7 hasil KLTP Bilangan gelombang (cm 1 ) Fraksi 4 5 Fraksi 4 7 Phalerin* 3399 3399 2922 2927 1919 2855 1618 1706 1511 1609 1436 1469 3387 2922 2698 1616 1512 1436 Dugaan gugus fungsi Gugus OH CH jenuh CH tak jenuh Regangan C=O Cincin aromatik C=C Cincin aromatik C=C Literatur Bilangan gelombang (cm 1 ) 30003700*** 28003000** 27003000*** 16501900*** 14501600** 14501600** Keterangan: *)Hartati et al. 2005; **)Fessenden & Fessenden J.S 1986; ***)Colthup et al. 1975 Fraksi 4 5 hasil KLTP yang diduga senyawa golongan benzofenon terbukti memiliki serapan pada panjang gelombang yang mirip dengan phalerin (glikosida benzofenon) yang berhasil diisolasi oleh Hartati et al. (2005) dari ekstrak metanol daun mahkota dewa.