4 Hasil dan Pembahasan α-amilase merupakan enzim yang mempunyai peranan penting dalam bioteknologi saat ini. Aplikasi teknis enzim ini sangat luas, seperti pada proses likuifaksi pati pada proses produksi sirup fruktosa jagung atau bahan bakar etanol, pada industri tekstil, industri pembuatan kertas, biomedis, dan industri-industri lain yang berbasiskan pati [Nazmi et al., 2006]. Gen bla yang mengkode α-amilase dari Bacillus licheniformis SITH galur lokal telah diklon ke dalam vektor ekspresi YEp-Secretex pada penelitian sebelumnya, dan juga telah diekspresikan di dalam ragi Saccharomyces cerevisiae [Oktaviani, 2006; Natalia et al., 2007]. Pada penelitian ini dilakukan produksi α-amilase rekombinan dalam ragi S. cerevisiae dan penentuan sidat-sifat biokimia α-amilase rekombinan. 4.1 Uji Kualitatif Aktivitas α-amilase Rekombinan dari B. licheniformis pada S. cerevisiae Penentuan aktivitas α-amilase rekombinan secara kualitatif dilakukan untuk mengetahui keberadaan ekspresi gen bla pengkode α-amilase dari B. licheniformis yang disisipkan pada plasmid YEp-Secretex dalam ragi S. cerevisiae. Ekspresi gen pada plasmid YEp-Secretex dikontrol oleh promotor hibrid galactose-phosfodegluceraldehydedekinase (GAL-PGK). Oleh karena itu, α-amilase rekombinan dapat diekspresikan jika ragi ditumbuhkan dalam media YNB padat yang mengandung galaktosa. α-amilase rekombinan ini disekresikan ke media pertumbuhan, karena gen BLA telah difusikan pada signal sequence invertase gen SUC pada plasmid YEp-Secretex. α-amilase rekombinan ini akan mengkatalisis reaksi hidrolisis pati yang terdapat pada media YNB padat. Ketika ditambahkan larutan KI/I 2 akan terlihat daerah bening dan gelap (Gambar 4.1 A dan B). Gambar 4.1 A menunjukkan kultur ragi S. cerevisiae yang membawa gen bla pada media YNB padat sebelum ditambahkan larutan KI/I 2. Gambar 4.1 B menunjukkan kultur ragi setelah ditambahkan larutan KI/I 2.
A B Gambar 4.1 Uji kualitatif aktivitas α-amilase rekombinan. Daerah gelap (biru kehitaman) pada Gambar 4.1 B menunjukkan terbentuknya kompleks iodin dengan pati. Daerah bening menunjukkan adanya aktivitas amilolitik α-amilase rekombinan, karena pada daerah ini tidak terbentuk kompleks iodin dengan pati yang menandakan bahwa pati di daerah ini telah terhidrolisis oleh enzim. 4.2 Optimasi Kadar Penginduksi untuk Produksi α-amilase Rekombinan Media pertumbuhan yang digunakan adalah media pertumbuhan 3xYEP. Pada tahap awal dilakukan penentuan kadar galaktosa untuk mengetahui kondisi optimum produksi α-amilase rekombinan. Konsentrasi galaktosa yang ditambahkan ke media produksi adalah 1%, 2%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, dan 5% (b/v). Inokulum disiapkan sebanyak 5 ml untuk 50 ml media produksi, lalu ditumbuhkan hingga nilai OD 600 selnya sekitar 0,6. Sel ragi dari inokulum diambil dengan cara sentrifugasi lalu ditumbuhkan pada media produksi. Setiap 24 jam waktu inkubasi dilakukan pengambilan sampel enzim untuk diuji aktivitasnya. Uji aktivitas enzim menggunakan Metode Fuwa [Fuwa, 1954]. Satu unit aktivitas didefinisikan sebagai penurunan absorban sebesar 10% selama 10 menit waktu reaksi per ml enzim. Aktivitas enzim pada berbagai kadar galaktosa terhadap waktu inkubasi dapat dilihat pada Gambar 4.2. Dari Gambar 4.2 dapat dilihat bahwa pada penambahan 1% galaktosa, aktivitas α-amilase rekombinan sangat kecil dengan harga maksimum sekitar 700 U.mL -1 setelah waktu inkubasi 96 jam. Untuk penambahan galaktosa 2% aktivitas optimum enzim diperoleh setelah waktu inkubasi 72 jam dengan aktivitas sebesar 1600 U.mL -1. Aktivitas optimum untuk penambahan galaktosa sebanyak 3% dan 4% diperoleh setelah dilakukan inkubasi selama 48 jam - 72 jam. Penambahan 3,5% galaktosa menghasilkan aktivitas optimum pada waktu inkubasi 96 jam. Untuk penambahan galaktosa 4,5% dan 5% aktivitas enzim mulai meningkat dengan tajam setelah dilakukan inkubasi selama 21
72 jam. Secara umum pada jam ke-72 hingga 96 jam terjadi peningkatan aktivitas (2%, 3%, 3,5%, 4,5%, dan 5%) dan penurunan aktivitas (4% galaktosa) tidak terlalu signifikan. U.mL-1 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0 24 48 72 96 120 144 Waktu Inkubasi (jam) 1% galaktosa 2% galaktosa 3% galaktosa 3,5% galaktosa 4% galaktosa 4,5% galaktosa 5% galaktosa Gambar 4.2 Aktivitas α-amilase rekombinan dengan variasi kadar galaktosa. Berdasarkan hasil optimasi penginduksi yang telah dilakukan, untuk produksi α-amilase rekombinan dalam jumlah yang lebih banyak dipilih kadar penginduksi 3% galaktosa dengan waktu inkubasi 72 jam. Pemilihan kadar penginduksi dan waktu inkubasi ini berdasarkan pada efisiensi biaya dan efisiensi waktu produksi. 4.3 Produksi α-amilase Rekombinan dan Fraksinasi Ammonium Sulfat Produksi α-amilase dilakukan dengan menyiapkan inokulum sebanyak 25 ml, lalu diambil sel raginya dengan cara sentrifugasi. Sel ragi ditumbuhkan pada media cair 3 x YEP yang mengandung 3% galaktosa sebanyak 500 ml. α-amilase rekombinan disekresikan ke media pertumbuhan (ekstraseluler), oleh karena itu enzim diambil dari kultur supernatan dengan alat sentrifuga. Supernatan yang mengandung enzim dipekatkan dengan fraksinasi ammonium sulfat. Endapan enzim dengan garam ammonium sulfat disentrifuga kembali. Garam ammonium sulfat dan enzim dipisahkan dengan dialisis menggunakan buffer phosfat 5 mm ph 7 di dalam kantong selofan. Untuk mengetahui enzim telah terbebas dari ammonium sulfat dilakukan uji kualitatif ammonium sulfat dengan larutan BaCl 2. Enzim hasil fraksinasi dan dialisis diperoleh sebanyak 24 ml. Nilai aktivitas total α-amilase rekombinan hasil fraksinasi ini adalah sebesar 2,77 x 10 5 U (pada suhu reaksi 70 C). 22
4.4 SDS-PAGE α-amilase Rekombinan Penentuan massa molekul α-amilase rekombinan dilakukan dengan SDS-PAGE. SDS berfungsi sebagai denaturan enzim membentuk molekul yang lebih linear dan menyebabkan enzim menjadi bermuatan negatif, sehingga saat dilakukan elektroforesis laju protein hanya dipengaruhi oleh ukuran protein. SDS-PAGE pada penelitian ini dilakukan dengan memodifikasi loading buffer tanpa penambahan β-merkaptoetanol dan menginkubasi sebagian gel elektroforesis dengan larutan pati. Marker protein (Rainbow, Amersham Life Science) digunakan untuk menentukan massa molekul enzim rekombinan. Pita biru marker protein diperoleh dari hasil visualisasi menggunakan larutan staining Coomassie Brilliant Blue R-250 (Gambar 4.3.B). Pita α-amilase rekombinan (Gambar 4.3.A) diperoleh dengan menginkubasi gel elektroforesis dalam larutan pati dan ditambahkan larutan KI/I 2. A B Gambar 4.3 Gel elektroforesis SDS-PAGE α-amilase rekombinan. Daerah gelap pada Gambar 4.3.A menunjukkan terbentuknya kompleks antara pati dengan iodin, sedangkan daerah terang menunjukkan pita α-amilase rekombinan yang telah menghidrolisis molekul pati, sehingga tidak terbentuk kompleks pati-iodin. Massa molekul enzim rekombinan ini diperoleh sekitar 68 kda. Gen bla yang diisolasi dari B. licheniformis galur lokal ini memiliki ukuran sebesar 1.453 bp [Oktaviani, 2006]. Massa molekul teoritis α-amilase ini adalah sebesar 53,27 kda. Hal ini menunjukkan bahwa α-amilase rekombinan yang diekspresikan dalam ragi 23
S. cerevisiae ini memiliki massa molekul yang lebih besar dari massa molekul teoritisnya. Hal ini dapat disebabkan karena α-amilase ini mengalami glikosilasi ketika diekspresikan dalam ragi S. cerevisiae. α-amilase yang dihasilkan oleh B. licheniformis dari galur yang berbeda memiliki perbedaan karakteristik karena disebabkan oleh perbedaan jumlah asam aminonya. Untuk α-amilase rekombinan, perbedaan jenis vektor ekspresi yang digunakan akan menghasilkan karakteristik enzim yang juga berbeda. Misalnya, α-amilase yang diisolasi dari B. licheniformis 44MB82-A memiliki massa molekul yang berbeda yaitu sebesar 58 kda [Ivanova et al., 1993]. 4.5 Penentuan Suhu Optimum α-amilase Rekombinan Penentuan suhu optimum α-amilase rekombinan dengan Metode Fuwa dilakukan untuk mengetahui suhu optimum yang memiliki aktivitas amilolitik α-amilase rekombinan maksimum. Aktivitas α-amilase rekombinan menunjukkan peningkatan dari suhu 30 C hingga suhu 70 C. Aktivitasnya optimum pada suhu 70 C dengan aktivitas sebesar 11,5 x 10 3 U.mL -1 (Gambar 4.4). Pada suhu 80 C dan 90 C aktivitas enzim mulai menurun hingga akhirnya relatif tidak aktif pada suhu 100 C. α-amilase wild type B. licheniformis 44MB82-A memiliki suhu optimum sekitar 90 C [Ivanova et al., 1993], maka α-amilase rekombinan dari B. licheniformis galur lokal ini memiliki sifat yang berbeda. 14000 12000 10000 U.mL-1 8000 6000 4000 2000 0 20 40 60 80 100 120 Temperatur (derajat ( C) C) Gambar 4.4 Aktivitas α-amilase rekombinan terhadap suhu. 24
4.6 Penentuan ph Optimum α-amilase Rekombinan Aktivitas α-amilase rekombinan dipengaruhi oleh ph atau konsentrasi H + dalam larutan. Penentuan ph optimum α-amilase rekombinan dilakukan dengan menguji aktivitas enzim pada ph yang berbeda, yaitu dari ph 3 sampai ph 10. Pada ph 3 dan ph 4 enzim tidak memiliki aktivitas (data tidak ditampilkan). Aktivitas enzim terhadap ph (dari ph 5-10) dapat dilihat pada Gambar 4.5. 10000 U.mL-1 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 4 5 6 7 8 9 10 11 ph Gambar 4.5 Aktivitas α-amilase rekombinan terhadap ph. Pada ph 5 aktivitas enzim sangat kecil, yaitu sekitar 5 x 10 2 U.mL -1. Pada ph 6 sampai ph 9 aktivitas enzim sangat tinggi. Enzim ini optimum pada ph 8 dengan aktivitas sekitar 9 x 10 3 U.mL -1. Pada ph yang lebih tinggi, yaitu ph 10 aktivitas enzim mulai berkurang sekitar 30 % dari aktivitas pada ph 9. Karakteristik ph optimum α-amilase rekombinan ini berbeda dibandingkan dengan α-amilase dari B. licheniformis 44MB82-A yang pernah dikarakterisasi sebelumnya dan diketahui optimum pada ph 6 dan 6,5 [Ivanova et al., 1993]. 4.7 Penentuan K M dan V maks Kinetika Reaksi α-amilase Rekombinan Penentuan kinetika reaksi α-amilase rekombinan dilakukan dengan metode DNS yang didasarkan pada pengukuran jumlah ujung pereduksi yang dihasilkan dari reaksi hidrolisis pati oleh enzim secara kolorimetri. Kecepatan (v) didefinisikan sebagai mg ujung pereduksi hasil hidrolisis pati oleh enzim per menit waktu reaksi. Konstanta Michaelis (K M ) dan kecepatan maksimum (V maks ) ditentukan dari aluran kurva Lineweaver-Burk [Dixon and Webb, 1979] 25
menggunakan laju awal reaksi untuk konsentrasi pati yang berbeda pada suhu 70 C (Gambar 4.6). Nilai K M reaksi yang menunjukkan afinitas enzim terhadap substrat pati diperoleh sebesar 4,24 mg.ml -1 dan nilai V maks reaksi sebesar 0,12 mg.ml -1.menit -1. Nilai K M α-amilase rekombinan ini berbeda α-amilase yang diisolasi dari B. licheniformis 44MB82-A dan telah dimurnikan, yang memiliki nilai K M sebesar 0,9 mg.ml -1. Nilai V maks kedua enzim ini hampir sama, karena α-amilase dari B. licheniformis 44MB82-A memiliki nilai V maks sebesar 0,1 mg.ml -1.menit -1 [Ivanova et al., 1993]. 26 24 1/v (ml.mnt.mg-1) 22 20 18 16 14 12 y = 35.34x + 8.1184 R 2 = 0.9778 10 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 1/[pati] ( ml.mg-1) Grafik 4.6 Kurva 1/v terhadap 1/[pati] kinetika reaksi α-amilase rekombinan. 4.8 Analisis Produk Hidrolisis α-amilase Rekombinan dengan TLC Analisis produk hidrolisis pati oleh α-amilase rekombinan ditentukan dengan menggunakan thin layer chromatography (TLC) menggunakan plat silika sebagai fasa diam dan fasa gerak berupa campuran pelarut organik. Plat TLC ditotolkan dengan produk hasil hidrolisis pati yang diambil sesaat setelah penambahan enzim hingga waktu inkubasi 24 jam. Sebagai standar digunakan campuran glukosa (G 1 ), maltosa (G 2 ), maltotriosa (G 3 ), maltotetraosa (G 4 ), maltopentaosa (G 5 ), maltoheksaosa (G 6 ), dan maltoheptaosa (G 7 ) yang ditotolkan pada plat TLC. Selanjutnya plat silika ini dielusi hingga diperoleh hasil kromatografi yang ditunjukkan pada Gambar 4.7. 26
Gambar 4.7 Analisis kromatografi produk hidrolisis pati. Gambar 4.7.1 menunjukkan produk hasil hidrolisis pati sesaat setelah enzim ditambahkan (0 jam). Gambar 4.7.2 sampai 4.7.6 berturut-turut menunjukkan produk hidrolisis pati setelah diinkubasi dengan enzim selama 1 jam, 2 jam, 4 jam, 7 jam, dan 24 jam. Pada plat hasil kromatografi terlihat peningkatan jumlah produk maltosa (G 2 ), maltotriosa (G 3 ), dan maltopentaosa (G 5 ) mulai dari awal hingga setelah 24 jam waktu inkubasi. Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa α-amilase rekombinan ini bersifat endoenzim karena enzim ini memotong molekul pati dari tengah yang diindikasikan oleh produk hidrolisisnya, yaitu maltosa (G 2 ), maltotriosa (G 3 ), dan maltopentaosa (G 5 ). α-amilase rekombinan dari B. licheniformis galur lokal ini memiliki sifat-sifat biokimia yang berbeda dengan α-amilase dari B. licheniformis galur lain, misalnya dengan α-amilase dari B. licheniformis 22MB82-A yang diperoleh dari hasil mutasi B. licheniformis MB80 dari Bulgarian Academy of Sciences. Perbedaan sifat-sifat α-amilase rekombinan B.licheniformis galur lokal dengan B. licheniformis 22MB82-A ditunjukkan pada Tabel 4.1. 27
Tabel 4.1 Karakteristik α-amilase rekombinan B. licheniformis galur lokal dan B. licheniformis 22MB82-A α-amilase dari B. licheniformis Massa molekul (kda) Suhu optimum ( C) ph optimum K M (mg.ml -1 ) V maks (mg.ml -1.mnt -1 ) Produk hidrolisis Rekombinan galur lokal 68 70 8 4,24 0,12 G 2, G 3, G 5 22MB82-A 58 90 6 ; 6,5 0,9 0,1 G 2 -G 6 28