BAB III METODE PENELITIAN A. Tempat Penelitian Penelitian yang meliputi pemeliharaan hewan coba, pemberian perlakuan dan pemeriksaam sampel darah dilakukan di laboratrium Pusat Studi Pangan dan Gizi Pusat Antar Universitas Universitas Gajah Mada Yogyakarta. B. Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2015 - januari 2016. Matrik jadwal penelitian ada pada lampiran 10. C. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik dengan randomized pre and post test control group design. Pada penelitian ini menggunakan lima kelompok perlakuan yaitu kelompok kontrol negative (KN), kontrol positif (KP), kelompok perlakuan satu (P1), kelompok perlakuan dua (P2) dan (P3) kelompok pelakuan tiga (Wahyuningrum, 2012).. D. Populasi dan Sampel Penelitian Populasi penelitian ini adalah tikus putih (Rattus norvegirus) jantan, strain wistar. Usia 8-9 minggu berat 180-200 gram. Jumlah sampel yang digunakan untuk penelitian ini adalah sebanyak 30 ekor tikus. Sampel tersebut diperoleh dari perhitungan besar sampel menurut rumus Federer yaitu (n-1) (t-1)>15 (Wahyuningrum, 2012). Perhitungan besar sampel : (n 1) (r 1) 15 (n 1) (5 1) 15 (n 1) 4 15 4n 4 > 15 4n > 19 n > 19/4 n 4,75 => n = 5 21
22 Keterangan : n : jumlah ulangan (replikasi) r : jumlah perlakuan Berdasarkan perhitungan besar sampel menurut Federer diperoleh sampel per kelompok adalah 5 ekor. Namun untuk menghindari drop out pada sampel ditambahkan 10% dan penambahan 10% dihasilkan jumlah sampel 5,5 yang dibulatkan menjadi 6 ekor. Jadi jumlah sampel pada penelitian ini adalah 5 ekor untuk setiap kelompok perlakuan. E. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas. Tepung daun kelor dengan dosis 500 mg/ kgbb/hari, 1000mg/ kgbb/hari, 1500 mg/ kgbb/hari 2. Variabel terikat : a. kadar glukosa darah b. kadar MDA 3. Variabel terkendali : jenis kelamin tikus, umur tikus, berat badan tikus, dosis streptozotocin dan nikotinamid, pakan standar tikus. F. Definisi Operasional Variabel 1. Tepung daun kelor dibuat dari daun kelor yang dipetik dari kota cilacap dengan tahap pengolahan daun segar menjadi daun kering, dilanjutkan pengolahan daun kering menjadi tepung daun dan dibagi menjadi dosis 500 mg/kg BB, 1000 mg/kg BB dan 1500 mg/kg BB (Velaga et all tahun 2014 dengan modifikasi) Satuan : mg Skala : rasio 2. Kadar glukosa darah adalah banyaknya glukosa yang terkandung dalam 1 dl atau darah tikus wistar yang diperiksa kuantitatif dengan metode enzimatik GODPAP (Hanifah, 2014). Satuan : mg/dl Skala data : rasio
23 3. Malondialdehyde (MDA) adalah produk peroksidasi lipid yang digunakan sebagai biomarker biologis untuk menilai stres oksidatif (Winarsi, 2007). Pemeriksaan MDA dilakukan menggunakan metode Thio Barbituric Acid Reactive Substance (TBARS) dengan spektofotometer (Dafriani, 2010). Satuan : nmol/ml. Skala data : rasio. G. Prosedur Penelitian 1. Alat dan Bahan a. Alat 1) Sonde lambung. 2) Tabung mikrohematokrit. 3) Rak tabung reaksi. 4) Tabung sentrifuge. 5) Gelas ukur kecil. 6) Spuit 5 ml. 7) Pengaduk. 8) Saringan. 9) Sentrifuge. 10) Pemanas water bath. 11) Cawan porselin. 12) Timbangan. 13) Kandang hewan percobaan beserta kelengkapan pemberian makanan. b. Bahan Bahan-bahan yang digunakan meliputi streptozotocin, nicotinamide, tepung daun kelor, kit pemeriksaan glukosa, dan kit untuk analisis MDA.
24 c. Bahan Pakan Tikus Komposisi pakan standar tikus Comfeed seperti pada Tabel 3.1. Tabel 3.1 pakan standar tikus comfeed Zat Gizi Comfeed/ 100 gram E (kkal) 344 P (gram) 19 L (gram) 4 KH (gram) 58 Sumber : Lutfiyah, 2015 2. Cara Kerja a. Pembuatan tepung daun kelor Pengolahan daun Kelor untuk membuat Serbuk Daun Kelor Premium metode Kelorina, terdiri dari beberapa tahapan proses pengolahan sebagai berikut : 1) Pengolahan Daun Segar a) Pemanenan Daun Segar Memilih daun segar berwarna hijau tua tanpa cacat. b) Pencucian Daun segar dimasukan ke dalam bak pencucian untuk menghilangkan kotoran, debu dan bagian tanaman lainnya. c) Penirisan Daun Kelor segar hasil ditiriskan agar air yang masih menempel pada daun dapat benar-benar hilang. d) Pengeringan Pengeringan dilakukan di dalam oven suhu dipertahankan stabil 40 0 C selama ± 10 jam sampai benar-benar kering. 2) Pengolahan Daun Kelor kering menjadi Tepung Daun a) Penepungan Daun kelor kering dihaluskan dengan menggunakan mesin penepung stainless steel/grinder penghancur.
25 b) Pengayakan Serbuk daun kelor disaring dengan ayakan stainless steel untuk menghasilkan serbuk daun dengan tingkat kehalusan diatas 40 mesh. (Krisnadi 2013 dengan modifikasi). b. Persiapan hewan coba 1) Pemeliharaan tikus Hewan coba yang digunakanadalah tikus sebanyak 30 ekor yang terlebih dulu diadaptasikan selama 7 hari dengan diberi makan dengan pakan standar dan minum secara ad libitum. Setelah adaptasi tikus dibagi secara acak menjadi lima kelompok dan ditempatkan dalam kandang khusus hewan coba secara terpisah. Pemeliharaan tikus dilakukan oleh petugas yang terlatih di laboratrium Pusat Studi Pangan dan Gizi Pusat Antar Universitas Gajah Mada Yogyakarta. 2) Induksi streptozotocin (STZ) dan nikotinamid (NA) Induksi streptozotocin (STZ) diberikan dengan dosis sedang dalam bentuk suntikan intraperitoneal. Dosis STZ dilarutkan dalam buffer sitrat (ph 4,5) dan nikotinamid dilarutkan dalam garam fisiologis normal. Model tikus diabetes melitus tipe 2 dibuat dengan cara menginduksi tikus dengan injeksi nicotinamide (110 mg/kg bb) dibagian intraperitoneal dan 15 menit kemudian diinjeksi dengan STZ (45 mg/kg bb). Hiperglikemia dikonfirmasi setelah 72 jam kemudian. Hewan dengan konsentrasi glukosa darah lebih dari 250 mg/dl dianggap diabetes melitus tipe 2 dan digunakan untuk percobaan (Ghazemi, 2014). 3) Kelompok perlakuan Tikus wistar dibagi menjadi lima kelompok secara acak masingmasing enam ekor dengan perlakuan berbeda. Pembagian kelompok sampel adalah sebagi berikut: a) Kelompok KN: Kontrol Negatif, tikus normal dengan pemberian akuades dan pakan standart comfeed secara ad libitum. b) Kelompok KP: Kontrol Positif, tikus DM pasca induksi STZ dan NA dengan pemberian akuades, pakan standart comfeed secara ad libitum.
26 c) Kelompok P1: tikus DM pasca induksi STZ dan NA dengan pemberian akuades pakan, standart comfeed secara ad libitum serta perlakuan dengan tepung daun kelor dosis 500 mg/kg BB/hari. d) Kelompok P2: tikus DM pasca induksi STZ dan NA dengan pemberian akuades pakan, standart comfeed secara ad libitum serta perlakuan dengan tepung daun kelor dosis 1000 mg/kg BB/hari. e) Kelompok P3: tikus DM pasca induksi STZ dan NA dengan pemberian akuades pakan, standart comfeed secara ad libitum serta perlakuan dengan tepung daun kelor dosis 1500 mg/kg BB/hari. c. Persiapan sampel uji Sebelum pengambilan darah tikus dipuasakan selama 10 jam dengan tetap diberikan air minum. Pengambilan darah dilakukan melalui plexus retroorbitalis pada mata dengan mikro hematokrit. Darah ditampung dalam mikrotube kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 1620 rpm. Selanjutnya sampel plasma darah dilakukan pengujian kadar glukosa darah dan MDA. d. Pengukuran kadar glukosa Kadar glukosa ditentukan secara enzimatik menggunakan penambahanenzim glukosa oksidase (GOD). Prisip kerja metode enzimatik dibantu enzim-enzim seperti contohnya katalase (reaksi Hantz) dan peroksidase (reaksi trinder). Pereagen menggunakan pereagen GOD-PAP. Absorbansi λ dan warna absorbansi metotde enzimatik intensitasnya paa λ 500 nm dengan warna merah (dari H2o2 yang terbentuk + peroksidasi). Dengan prinsip dasar glukosa dioksidasi oleh oksigen dengankatalis enzim glukosa oxidase (GOD) akan membentuk asam glukonik dan hydrogen peroksida (H2O2). Dnagn adanya oksigen atau udara, glukosa dioksidasi oleh enzim menjadi asam glukorunat disertai pembentukan H2O2. Enzim peroksidase (POD) mengakibatkan H2O2 membebaskan O2 yang mengoksidasi akseptor kromogen yang sesuia serta member warna yang sesuai. Kadar glukosa darah ditentukan berdasarkan intensitas warna yang
27 terjadi, diukur secara spektofotometri. Hydrogen peroksida akan bereaksi dengan 4-aminoantiyrin dan fenol dengan katalis peroksidase (POD) membentuk quinoimine dan air. Quinoneimine ini merupakan indicator yang menunjukkan kadar glulosa dalam darah. Darah diambil dari sinus orbitalis tikus kemudian disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 2500. Serum sebanyak 10 µl kemudian ditambah dengan 1 ml reagen GOD-PAP, divortek selama 5 detik kemudian diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 10 menit. Absorbansi diukur dengan spektofotometer pada panjang gelombang 500 nm (Dafriani, 2010) e. Pengukuran MDA MDA diukur menggunakan metode TBARS, yakni mengukur konsentrasi Thiobarbituric Acid Reactive Substance. Asam fosfat sebanyak 750 µl dimasukkan dengan pipet ke dalam tabung polypropilen 13 ml. kemudian ditambah 50 µl TEP standar/pengontrol kualitas/sampel plasma/aquades ke dalam tabung. Campuran dikocok sampai homogeny keudian ditambahkan 250 µl larutan TBA 40 mm. aquades sebanyak 450 µl ditambahkan ke dalam tabung dan tabung ditutup rapat. Campuran dipanaskan selama satu jam, setelah pemanasan tabung ditempatkan ke dalam ice bath untuk mendinginkan sampel. Sampel yang sudah dingin diaplikasikan ke dalam set-pak C 18 Culumn. Absorbansi diukur dengan spektofotometer dengan panjang gelombang 532 nm (Dafriani, 2010). f. Pengumpulan data Data yang dikumpulkan adalah data primer berupa kadar glukosa darah dan kadar MDA sebelum dan sesudah pemberian tepung daun kelor. Analisis kadar glukosa menggunakan metode enzimatic colorimetric test GODPAP dan analisis status antioksidan dengan pengukuran MDA menggunakan metode TBARS C 18.
28 g. Euthanasia hewan coba Setelah pengambilan sampel darah pasca perlakuan, dilakukan proses euthanasia dengan larutan eter ( dengan kapas yang dibasahi eter, masukkan dalam suatu tempat yang sesuai besar hewan cobanya (toples), kemudian tikus dimasukkan dalam tempat tersebut, ditunggu sampai mati ). Setelah dipastikan mati, kemudian bakar.
29 H. Diagram Alur Penelitian Tikus wistar aklimatisasi 7 hari Non induksi STZ dan NA Induksi STZ dan NA untuk pembuatan DM-2 3 hari KN KP P1 P2 P3 Pakan standar Pakan standar Pakan standar Pakan standar Pakan standar Pengukuran Glukosa darah dan ROS(MDA) sebelum perlakuan KN Pakan standar KP Pakan standar P1( 500 mg/kgbb) Pakan standar P2 (1000 mg/kgbb) Pakan standar P3 (1500 mg/kgbb) Pakan standar 7 hari Pengukuran Glukosa darah dan ROS(MDA) sesudah perlakuan Analisis Statistik KETERANGAN KN: kontrol negatif TDK : Tepung daun kelor Post : sesudah perlakuan KP: kontrol positif MDA : Malondialdehyde STZ : streptozotocin Pn: kelompok perlakuan Pre : sebelum perlakuay NA : nikotinamid
30 I. Analisis Data Data yang diperoleh diolah menggunakan program komputer IBM SPSS Statistics 21. Pertama, dilakukan uji normalitas dengan menggunakan Shapiro- Wilk. Data berdistribusi normal jika nilai p>0,05. Selanjutnya dilakukan uji homogenitas data dengan nilai p>0,05 dengan pengertian data mempunyai varian yang homogen. Perbedaan dari 5 kelompok perlakuan dianalisis menggunakan uji statistik dengan paired samples Ttest. Selanjutnya dilakukan uji regresi untuk mengetahui seberapa besar pengaruh pemberian tepung daun kelor terhadap penurunan glukosa darah dan malondialdehyde (MDA).