REPLIKASI DAN POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

REPLIKASI DAN POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Debbie S. Retnoningrum Sekolah Farmasi, ITB Pustaka: 1. Glick, BR and JJ Pasternak, 2003, hal. 27-28; 110-120 2. Groves MJ, 2006, hal. 40 44 3. Brown TA, 2006, hal 6-7; 181-193

DOGMA SENTRAL BIOLOGI MOLEKULER Replikasi dan PCR 2

REPLIKASI Replikasi adalah penggandaan DNA Sintesis 2 molekul DNA dari 1 molekul DNA Konsep pasangan basa Arah 5 ke 3 pada untai yang disintesis Dikatalisis oleh DNA polimerase www.uic.edu/.../lecture4/replication4.jpg Replikasi dan PCR 3

Komponen komponen Replikasi DNA Mulai pada origin of replication (ori) Protein pengikat DNA untai tunggal Helikase (pembuka untai) Primase (RNA polimerase) DNA polimerase Replikasi dan PCR 4

Replikasi DNA REPLIKASI DNA: Pemanjangan untai baru DNA dntp: datp, dttp, dgtp, dctp Dikatalisis oleh DNA polimerase Replikasi dan PCR 5

DNA Polimerase Prokariot Pol I Pol II Pol III Eukariot Pol-α Pol-β Pol-δ Pol-γ Pol-ε Fungsi Gap filling & DNA repair Gap filling & DNA repair Replikasi Replikasi lagging strand Gap filling & DNA repair Replikasi leading strand Replikasi pada mitokondria Gap filling & DNA repair Replikasi dan PCR 6

Polymerase Chain Reaction (PCR) Karry Mullis, penemu PCR Pemenang hadiah Nobel Replikasi dan PCR 7

SIKLUS PCR SIKLUS 1 SIKLUS 2 SIKLUS 3 T 94 o C 72 o C 55 o C WAKTU (DETIK) Replikasi dan PCR 8

SIKLUS PCR dan HASIL AMPLIFIKASI Replikasi dan PCR 9

Polymerase Chain Reaction (PCR) www.scq.ubc.ca/wp-content/uploads/2006/07/pcr.gif Replikasi dan PCR 10

KOMPONEN PCR cetakan DNA oligonukleotida pendek (primer) DNA polimerase termostabil :Taq Polymerase (Thermus aquaticus) & buffer dntp (datp, dttp, dctp dan dgtp) Replikasi dan PCR 11

Genom yang ditentukan urutannya http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome Replikasi dan PCR 12

Contoh informasi pada data genbank Replikasi dan PCR 13

Amplifikasi DNA target dalam genom organisme Replikasi dan PCR 14

Amplifikasi DNA target dalam genom organisme Replikasi dan PCR 15

DETEKSI PRODUK PCR Replikasi dan PCR 16

Replikasi dan PCR 17

PCR untuk deteksi Patogen P1 GEN TARGET P2 PRODUK PCR: 490 pb TARGET HARUS SPESIFIK PATOGEN Replikasi dan PCR 18

PCR UNTUK DETEKSI PATOGEN DETEKSI Mycobacterium tuberculosis DNA TARGET: FRAGMEN TARGET IS6110 BERSALINAN TINGGI Bahan dahak DETEKSI Chlamydia trachomatis DNA TARGET: GEN MAJOR OUTER MEMBRANE PROTEIN = MOMP Bahan usap vagina (4), darah (5), mata (6) Replikasi dan PCR 19

MODIFIKASI PCR PCR-HIBRIDISASI (PRODUK PCR DIHIBRIDISASI DENGAN PELACAK) PCR multipleks Nested-PCR PCR-sekuensing Real-time PCR Replikasi dan PCR 20

PRINSIP HIBRIDISASI Hybridization Addition of probe Denaturation Replikasi dan PCR 21

PCR HIBRIDISASI DENGAN DETEKSI KOLORIMETRI lisis PCR deteksi kolorimetri Σ molekul target Σsinyal denaturasi substrat hibridisasi Replikasi dan PCR 22

DETEKSI KOLORIMETRI TMB H2O2 Avidin Biotin Horse radish peroxidase Produk PCR Pelacak Replikasi dan PCR 23

PCR MULTIPLEKS PASANGAN PRIMER UNTUK DNA TARGET > 1 CONTOH: Escherichia coli: GEN TARGET gen LT1, ST1, SLT1, SLT2, VT1, VT2, VTE 7 PASANGAN PRIMER 7 PRODUK PCR Replikasi dan PCR 24

HASIL PCR MULTIPLEKS S A B C D LT1 ST1 SLT1 SLT2 VT1 VT2 VTE Replikasi dan PCR 25

Contoh Hasil PCR multipleks Replikasi dan PCR 26

Nested-PCR GEN FLAGELIN S. typhi ST1 458 pb ST3 PCR pertama ST4 ST2 PCR kedua 343 pb Replikasi dan PCR 27

Replikasi dan PCR 28

PCR SEKUENSING Replikasi dan PCR 29

PCR REAL-TIME PCR KONVENSIONAL: TAHAP AMPLIFIKASI DAN DETEKSI TERJADI SECARA KONSEKUTIF PCR REAL-TIME TAHAP AMPLIFIKASI DAN DETEKSI TERJADI SECARA SIMULTAN Replikasi dan PCR 30

Deteksi pada PCR konvensional Replikasi dan PCR 31

Daerah deteksi real-time PCR Replikasi dan PCR 32

PELACAK HIBRIDISASI Replikasi dan PCR 33

PELACAK HIBRIDISASI Replikasi dan PCR 34

Contoh hasil realtime PCR Replikasi dan PCR 35