Bab III Metodologi Penelitian III.1 Pengumpulan dan Persiapan Sampel Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun Artocarpus champeden Spreng yang diperoleh dari Kp.Sawah, Depok, Jawa Barat, pada bulan Februari 2007. Daun tersebut kemudian dikeringkan di bawah sinar matahari langsung sampai beratnya relatif tidak berubah, kemudian dihaluskan hingga berupa serbuk. III.2 Alat dan Bahan III.2.1 Alat Pada tahap isolasi dan pemisahan senyawa, peralatan yang digunakan adalah peralatan gelas yang umum digunakan di laboratorium Kimia Organik Bahan Alam, peralatan destilasi, rotary evaporator, peralatan kromatografi radial, kromatografi tekan, kromatografi gravitasi menggunakan sephadex dan kolom untuk KVC. Pada tahap karakterisasi peralatan yang digunakan adalah spektrofotometer ultraviolet Variant Conc. 100, spektrofotometer FTIR Perkin Elmer Spectrum One, spektrometer NMR JEOL JNM A5000 yang beroperasi pada frekuensi 500 MHz NMR ( 1 H) dan 125 MHz ( 13 C) dengan menggunakan TMS sebagai standar internal, alat pengukur titik leleh Fisher-Johns melting point apparatus, dan alat polarimeter Perkin Elmer 341. III.2.2 Bahan Bahan kimia yang digunakan meliputi berbagai pelarut organik, silika gel, dan pereaksi penampak noda pada kromatografi lapis tipis (KLT). Pelarut yang digunakan antara lain adalah metanol teknis, aseton teknis, etil asetat teknis, n- heksan teknis, yang kemudian di destilasi serta kloroform proanalis. Jenis-jenis silika gel yang digunakan dalam penelitian ini antara lain silika gel Merck 60 GF 254 untuk kromatografi vakum cair (KVC), Silika gel Merck 60 PF 254 untuk kromatografi radial, silika gel Merck ukuran 35-70 mesh untuk impregnsi, silika gel Merck ukuran 230-400 mesh untuk kromatografi tekan, silika gel Merck ukuran 200 mesh untuk kromatografi gravitasi dan pelat alumunium berlapis silika gel Merck Kieselgel 60 GF 254 dengan ketebalan 0, 25 mm untuk analisis KLT.
21 Pereaksi untuk uji kualitatif yaitu 3% serium sulfat dalam asam sulfat 2N. Pada karakterisasi bahan-bahan yang digunakan yaitu larutan NaOH dan MeOH untuk spektroskopi UV, KBr untuk spektroskopi IR, aseton D-6 untuk spektroskopi ( 1 H) NMR. III.3 Cara Kerja Ekstraksi dan Isolasi Penelitian yang dilakukan ini terdiri dari beberapa tahap, yaitu tahap ekstraksi, pemisahan dan pemurnian dengan berbagai teknik kromatografi. Kemurnian senyawa hasil isolasi ditetapkan berdasakan analisis KLT. Penentuan struktur ditentukan dengan menggunakan metoda spektroskopi yaitu spektroskopi UV, IR, 1 H NMR, dan 2D NMR (COSY dan NOESY). III.3.1 Ekstraksi senyawa dari daun Artocarpus champeden Serbuk daun Artocarpus champeden sebanyak 2,7 kg dimaserasi dengan metanol selama 24 jam, kemudian dilakukan penyaringan. Ekstrak metanol yang diperoleh kemudian dikeringkan sebagian dengan rotary evaporator. III.3.2 Pemisahan dan pemurnian senyawa Ekstrak metanol hasil evaporasi kemudian ditambah air dengan volume yang sama dan kemudian disimpan di tempat gelap selama 24 jam, untuk mengendapkan klorofil yang terdapat di daun. Setelah terbentuk endapan klorofil di dasar tabung, ekstrak kemudian disaring, dan dilanjutkan dengan proses partisi dengan n-heksan untuk memisahkan klorofil yang masih tersisa pada ekstrak metanol-air tersebut. Ekstrak metanol-air kemudian dipartisi dengan pelarut etil asetat sebanyak 3 kali, dan fraksi etil asetat yang diperoleh dikeringkan sehingga diperoleh ekstrak etil asetat yang berwarna hijau kehitaman pekat sebanyak 57 gram. Ekstrak tersebut kemudian melalui beberapa tahap proses pemisahan menggunakan metode yang lazim digunakan. Diagram alir pemisahan senyawa flavonoid fraksi Etil Asetat ditunjukkan pada gambar III.1
22 Serbuk daun A. champeden 2,7 kg Ekstraksi (MeOH) Filtrasi Evaporasi Ekstrak metanol pekat + air Didiamkan selama 24 jam Ekstrak metanol-air Endapan klorofil Partisi dengan n-heksan Fraksi n-heksan Fraksi metanol-air Partisi dengan etil asetat Fraksi Etil Asetat 57 g Fraksi metanol-air KVC 20 g ekstrak etil asetat Fraksi A Fraksi B Fraksi C Fraksi D Senyawa murni Berbagai teknik kromatografi Gambar III.1 Diagram alir pemisahan senyawa Flavonoid
23 Ekstrak etil asetat sebanyak 20 gram kemudian difraksinasi dengan teknik kromatografi cair vakum (KCV) menggunakan eluen heksan-etil asetat yang ditingkatkan kepolarannya secara bertahap sehingga diperoleh 4 fraksi utama yaitu A (fraksi 1-6), B (fraksi 7-11), C (fraksi 12-15), dan D (fraksi 16-18). Kromatogram hasil KCV dengan eluen etil asetat (100%) ditunjukan pada gambar III.2. Gambar III.2 Kromatogram hasil KCV fraksi etil asetat Fraksi B sebanyak 800 mg kemudian dipisahkan lebih lanjut dengan kromatografi radial menggunakan eluen etil asetat: n-heksan (4 : 6) dengan kepolaran yang ditingkatkan bertahap. Pemisahan fraksi B menghasilkan 5 fraksi utama, yaitu B1 (fraksi 1), B2 (fraksi 2-3), B3 (fraksi4-6), B4 (fraksi 7), dan B5 (fraksi 8-9). Gambar III.3 Kromatogram hasil kromatografi radial fraksi B; eluen etil asetat: n-heksan (4 : 6) Fraksi B3 menunjukkan pola satu noda dengan pengotor yang bersifat lebih polar, sehingga fraksi tersebut kemudian dimurnikan dengan teknik kromatografi radial menggunakan eluen aseton:kloroform:n-heksan (4:5:1). Hasil pemurnian tersebut, kemudian diuji dengan kromatografi lapis tipis dengan sistem tiga eluen.
24 Dari kromatogram uji kemurnian (gambar III.4) dua sistem eluen menunjukkan pola satu noda, dan satu sistem eluen terlihat adanya pengotor yang bersifat lebih non polar sehingga dilakukan pemurnian lebih lanjut terhadap fraksi B3 sehingga diperoleh senyawa murni untuk proses pengujian selanjutnya. Gambar III.4 Kromatogram uji kemurnian dengan 3 sistem eluen fraksi B3 eluen (a) heksan:aseton (1 :1), (b) kloroform:aseton(4:6), (c) heksan:etil asetat (1:9) Fraksi B2 dengan pola noda yang cukup terpisah baik pada kromatografi lapis tipis dengan eluen aseton:kloroform (1:1) kemudian dilakukan pemisahan dengan teknik kromatografi radial. Dari pemisahan tersebut diperoleh 6 fraksi, yaitu B21(1-2), B22(3-4), B23(5-6), B24(7), B25(8-9), dan B26(10). Gambar III.5 Kromatogram hasil kromatografi radial fraksi B2; eluen kloroform: metanol (9 : 1) Fraksi B23 menunjukkan pola satu noda dengan pengotor yang bersifat lebih non polar yang terpisah dengan baik, selanjutnya dimurnikan dengan teknik kromatografi gravitasi menggunakan pipet kolom dengan eluen
25 kloroform:metanol (8½:1½). Hasil pemurnian dengan pipet kolom tersebut memperlihatkan pola satu noda pada fraksi B233 sebanyak 4 mg (gambar III.6). Gambar III.6 Kromatogram hasil kromatografi gravitasi fraksi B23; eluen kloroform: metanol (8½:1½) Fraksi tersebut kemudian diuji kemurniannya dengan kromatografi lapis tipis menggunakan 3 sistem eluen. Dari kromatogram uji kemurnian (gambar III.7) diketahui bahwa fraksi B233 merupakan senyawa murni. Gambar III.7 Kromatogram uji kemurnian dengan 3 sistem eluen fraksi B233 eluen (a) heksan:etil asetat (1:2), (b) kloroform: metanol (8½:1½), (c) kloroform:aseton(3:7) Selanjutnya dilakukan pemisahan terhadap fraksi C sebanyak 800 mg dengan teknik kromatografi radial dengan eluen etil asetat (100%). Dari pemisahan fraksi C tersebut diperoleh 6 fraksi, yaitu Ca, Cb, Cc, Cd, Ce, Cf, dengan kromatogram ditunjukan pada gambar III.8
26 Gambar III.8 Kromatogram hasil pemisahan fraksi C; Eluen etil asetat (100%) Dari kromatogram diatas (gambar III.8) diketahui bahwa Cb memiliki pola noda dan nilai Rf yang sama dengan B3, maka kedua senyawa ini merupakan senyawa yang sama. Selanjutnya dilakukan pemisahan terhadap fraksi Ce, yang terlihat memiliki pola satu noda dengan pengotor yang bersifat lebih non polar dan polar. Pemisahan dilakukan dengan teknik kromatografi radial menggunakan eluen klorofrom:etil asetat:metanol (4:6:1). Hasil pemisahan menunjukkan pola satu noda pada fraksi Ce2 (8-14) (Gambar III.9). Gambar III.9 Kromatogram hasil kromatografi radial fraksi Ce; eluen kloroform:etil asetat:metanol (4:6:1) Fraksi tersebut kemudian diuji kemurniannya dengan kromatografi lapis tipis menggunakan 3 sistem eluen. Dari kromatogram uji kemurnian (gambar III.10) diketahui bahwa fraksi Ce2 merupakan senyawa murni. Setelah dilakukan
27 karakterisasi dengan menggunakan spektroskopi NMR, terlihat adanya pengotor yang signifikan sehingga senyawa Ce2 perlu dimurnikan lebih lanjut. Gambar III.10 Kromatogram uji kemurnian dengan 3 sistem eluen fraksi Ce2 eluen (a) kloroform: metanol (8:2), (b) kloroform:etil asetat: metanol (5:5:1), (c) heksan:aseton(2:8) III.3.3 Penentuan struktur senyawa hasil isolasi Struktur molekul senyawa yang berhasil di isolasi ditentukan berdasarkan analisis data spektroskopi yang meliputi data spektroskopi UV, IR, 1 H NMR, dan 2D NMR (COSY dan NOESY). Data spektrum UV ditujukan untuk mengetahui jenis kromofor. Data spektrum IR untuk mengetahui gugus fungsi yang ada pada senyawa. Data spektrum 1 H NMR untuk menentukan unit-unit struktur. Data spektrum NOESY untuk mengidentifikasi proton-proton yang memiliki kedekatan ruang.