BAB III METODE PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pangan dan Gizi dan di Laboratorium Mikrobiologi Pangan dan Bioteknologi, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret Surakarta. Laboratorium lain adalah di Unit Pembantu Teknis Laboratorium Biologi Pusat Matematika dan Ilmu Pangetahuan Alam (MIPA), Universitas Sebelas Maret Surakarta. Waktu pelaksanaan penelitian adalah pada bulan Desember 2015 hingga Mei 2016. B. Alat dan Bahan 1. Alat Alat yang dibutuhkan dalam penelitian antara lain membran selofan (MWCO 12 KDa), hemocytometer (Neubaeur Assistant), mikroskop binokuler (Yazumi), neraca analitik (Mettler Toledo), waterbath (Memmert), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu), vortex (Heidolph), sentrifuge (Hettich), laminar air flow (Labconco), autoklaf (Selecta), inkubator (Selecta), hot plate dan stirrer (IKA Labortechnick), cool chamber, incubator shaker, mortar dan peralatan gelas yang umum digunakan dalam laboratorium. 2. Bahan Bahan utama dalam penelitian ini adalah kulit pisang raja nangka yang diperoleh dari UPPKS Bhakti Kencana, Karanganyar yang digunakan sebagai bahan media fermentasi. Limbah kulit pisang yang digunakan adalah limbah kulit dari pisang raja nangka mengkal (sudah tua namun belum matang) dengan ciri-ciri masih berwarna hijau dan sudut kulit tidak tajam dan tidak tumpul. Bagian kulit yang digunakan adalah bagian kulit tengah pada buah pisang. Potongan bagian ujung buah dan pangkal tidak digunakan. Limbah ini dikumpulkan dalam kondisi segar (setelah dikupas). Foto kenampakan fisik buah pisang raja nangka terlampir pada Lampiran 13.A. 17
18 Isolat bakteri AR2 untuk produksi enzim diperoleh dari penelitian Kalistyastika (2014). Isolat ini diisolasi dari limbah sayuran pasar lokal di Surakarta, Indonesia. Karakterisitik morfologi dari isolat ini adalah berbentuk batang, berupa rantai, gram negatif dan berukuruan 0,5 µm. Bahan penunjang media fermentasi yang lain adalah amonium sulfat (Fawole dan Odunfa, 2003), larutan HCl 2 M dan larutan NaOH 3 M yang digunakan untuk pengaturan ph media fermentasi (Malvessi dan Silveira, 2004). Sedangkan bahan-bahan yang digunakan dalam analisis penelitian antara lain asam klorida (HCl), Alkohol 96%, reagen Dinitro Salisilat ((NO2)2C6H2(OH)COOH + H2O)(SIGMA), Bovine Serum Albumine, buffer asetat, kalium-natrium-tartrat tetrahidrat (C4H4KNaO6.4H2O) (MERCK), pektin sitrus (SIGMA), bacteriological agar (SIGMA), asam galakturonat, natrium klorida (NaCl) (MERCK), natrium asetat (CH3COONa) (MERCK), asam asetat (CH3COOH) (MERCK), asam fosfotungstat-asam fosfomolibdat, natrium karbonat (Na2CO3) (MERCK), natrium hidroksida (NaOH) (MERCK), fenol(c6h5oh), tembaga sulfat (CuSO4)(MERCK) dan barium klorida (BaCl2) (MERCK). C. Tahapan Penelitian 1. Penentuan Kadar Pektin dan Protein Total Kulit Pisang Limbah kulit pisang raja nangka disortasi dan dikumpulkan setelah dilakukan pengupasan. Kulit pisang tersebut lalu dimasukkan dalam cool box yang telah terisi ice gel untuk mencegah terjadinya reaksi pencoklatan. Sampel kulit pisang kemudian dicuci dengan air mengalir, kemudian dianalisis kadar pektin awal menggunakan metode Sulihono dkk. (2012) dan penentuan kadar protein total menggunakan metode Kjeldahl (AOAC, 2005). 2. Pembuatan Media Produksi Enzim Untuk membuat media produksi mula-mula kulit pisang dicuci, diblanching pada suhu 100 C selama 6 menit untuk 100 g bahan (Restiana dkk., 2014), dipotong-potong dan dihancurkan menggunakan mortar hingga halus. Untuk membuat 100 ml media dengan kadar pektin 5%
19 (w/v), dilakukan dengan cara diambil 13,18 g sampel halus kemudian dilarutkan dengan aquades hingga volume 100 ml. Perhitungan banyaknya sampel yang diambil tersebut berdasarkan hasil uji kadar pektin awal kulit pisang. Pada media ditambahkan nitrogen anorganik berupa ammonium sulfat pada konsentrasi 0,5% (w/v). kadar pektin media 5 % dan ammonium sulfat 0,5% berdasarkan pada penelitian Safitri (2015) bahwa pada konsentrasi tersebut, dihasilkan enzim poligalakturonase dengan aktivitas tertinggi yaitu 0,134 U/ml. Pengaturan ph sebagai variasi perlakuan dalam penelitian ini dilakukan dengan menggunakan larutan HCl 2 M dan NaOH 3 M. Media diatur pada ph 5,0; 6,0 dan 7,0. Penentuan ph awal media ini berdasarkan pada Kalistyatika (2014), yang menyatakan bahwa aktivitas enzim poligalakturonase dari isolat AR2 dapat berjalan stabil pada ph 4 hingga ph 6. Pada penelitian lain, ph awal untuk produksi poligalakturonase adalah pada ph 6,5 (Darah et al., 2013), ph 5,8 (Yannam et al., 2014), dan ph 5,5 (Thangaratham dan Manimegalai, 2014). Kemudian semua medium disterilisasi menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 C. 3. Subkultur dan Penyiapan Starter Isolat AR 2 Subkultur dilakukan sebelum starter disiapkan dengan cara mengambil 1 oose kultur AR2 dari koleksi ke dalam media pektin agar miring. Kemudian diinkubasi pada suhu 55 C selama 24 jam. Setelah itu, penyiapan starter isolat AR2 dilakukan dengan cara mengambil 1 oose dari subkultur ke dalam 10 ml media pektin cair. Inkubasi starter dilakukan pada suhu 55 C selama 24 jam hingga jumlah sel mencapai 10 8 sel/ml (Safitri, 2015). 4. Produksi Enzim Produksi enzim dilakukan dengan menambahkan 1 ml larutan starter AR2 dengan jumlah 10 8 sel/ml pada 100 ml media produksi enzim di dalam erlenmeyer 250 ml. Inkubasi secara aerob dilakukan dalam inkubator pada suhu yang berbeda-beda sebagai variasi perlakuan kedua.
20 Suhu inkubasi yang digunakan adalah suhu 45 o C (Madu et al., 2014), 55 o C (Rahayu, 2014) dan 65 o C (Swain et al., 2009) dalam rotary shaker dengan kecepatan 144 rpm (Widowati dkk., 2014) dan inkubasi selama 48 jam (Madu et al., 2014). 5. Analisis Akhir Fermentasi Analisis akhir yang dilakukan pada penelitian ini adalah perhitungan jumlah mikroba yang ada dalam sampel dan perhitungan terhadap jumlah pektin sampel di akhir fermentasi. Metode perhitungan jumlah sel bakteri dalam sampel menggunakan hemositometer (Hadioetomo, 1993) dengan rumus perhitungan: X (hasil penghitungan 5 kotak sedang) Jumlah sel/ml = xfaktor pengenceran Jumlah kotak sedang x 4.10-6 Sedangkan analisis kadar pektin akhir dilakukan dengan mengambil sebanyak 20 gram media fermentasi dan selanjutnya dianalisis dengan metode Sulihono dkk. (2012) yang dimodifikasi dari rasio berat sampel dan pelarut aquades (Safitri, 2015). 6. Isolasi dan Pemurnian Parsial Enzim Enzim poligalakturonase dalam penelitian ini termasuk enzim ekstraseluler. Sehingga saat pemanenan enzim tidak perlu dilakukan pemecahan sel mikroba. Setelah selesai fermentasi, media produksi diambil sebanyak 60 ml kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 C (Widowati dkk., 2014). Supernatan yang telah diperoleh dimurnikan dengan 2 tahap, yaitu presipitasi dengan ammonium sulfat dan desalting menggunakan dialisis. - Presipitasi ammonium sulfat Supernatan hasil sentrifugasi sebelumnya dipresipitasi dengan ammonium sulfat pada fraksi kejenuhan 50% dengan agitasi (Kalistyatika, 2014), larutan ini dibiarkan selama 24 jam pada suhu 4 C untuk memisahkan enzim. Setelah terpisah, lapisan endapan kemudian disentrifugasi pada 12.000 rpm pada suhu 4 C selama 10 menit (Widowati dkk., 2014).
21 - Desalting menggunakan dialisis Hasil sentrifugasi yakni enzim dalam bentuk pellet dilarutkan dalam buffer asetat 0,05 M dan ph 5,2 (1:1). Kemudian didialisis dalam kantung membran selofan cut off 12 kda dan direndam dalam 300 ml larutan buffer asetat 0,05 M dan ph 5,2 dalam gelas beker 600 ml. Homogenisasi dilakukan menggunakan magnetic stirrer selama 24 jam dalam cool chamber, pada suhu 4 C (Widowati dkk., 2014). Larutan buffer diganti setiap enam jam. Uji kualitatif BaCl2 dilakukan untuk memastikan ammonium sulfat dan partikel pengotor lainnya telah keluar dari membran selofan. Tiga tetes BaCl2 0.1 M ditambahkan ke dalam larutan buffer yang ada di luar kantung selofan. Ion-ion sulfat (SO4 2- ) akan membentuk endapan putih BaSO4 (Wardani dan Nindita, 2012). 7. Pengujian Enzim Murni Parsial Enzim murni parsial diukur aktivitas enzimnya yang ditentukan dari pembebasam asam galakturonat per menit pada kondisi uji dengan menggunakan DNS (Ordonez et al., 1998; Apriyantono dkk., 1989). Sedangkan konsentrasi protein enzim diukur menggunakan metode Lowry berdasarkan pada reaksi protein dengan asam fosfotungstat-fosfomolibdat pada suasana alkalis yang akan memberikan warna biru. Intensitas warna yang dihasilkan sesuai konsentrasi dari protein tersebut (Sudarmadji dkk., 1997). Dari hasil aktivitas enzim dan konsentrasi protein dapat ditentukan aktivitas spesifik enzim untuk mengetahui tingkat kemurniannya (Winarno, 1983). Diagram alir tahapan penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 3.1.
22 Limbah Kulit Pisang Isolat Bakteri AR 2 Peremajaan isolat dan penyiapan starter bakteri AR 2 Starter Bakteri AR 2 Penentuan kadar pektin dan protein total kulit pisang Pembuatan media produksi dengan kadar pektin 5% dan amonium sulfat 0,5 % Media produksi Produksi Enzim dengan variasi Suhu 45 o C, 55 o C, 65 o C dan variasi ph 5,0; 6,0 dan 7,0 Analisis Akhir fermentasi: 1. Jumlah Sel Akhir 2. Kadar pektin akhir Ekstraksi dan pemurnian enzim poligalakturonase Gambar 3.2 Diagram Alir Tahapan Penelitian Penentuan: 1. Aktivitas enzim 2. Konsentrasi protein enzim 3. aktivitas spesifik enzim
23 D. Metode Analisis Jenis uji dan metode analisis penelitian ini tercantum pada Tabel 3.1. Tabel 3.1 Metode Analisis Produksi Poligalakturonase No Tahapan Penelitian Uji Analisis 1. Penentuan kadar pektin dan protein total kulit pisang - Kadar pektin (Sulihono dkk., 2012) - Kadar protein total (AOAC, 2005) 2. Produksi enzim dan analisis akhir fermentasi - Jumlah bakteri (Widowati dkk, 2014; Hadioetomo, 1993) - Kadar pektin (Modifikasi Sulihono, 2012) 3. Pemurnian parsial - Pemurnian parsial enzim (Widowati dkk., 2014; Kalistyatika 2014; Wardani dan Nindita, 2012) - Aktivitas enzim Poligalakturonase (Ordonez et al., 1998; Apriyantono dkk., 1989 ) - Konsentrasi protein enzim (Sudarmadji dkk., 1997) - Aktivitas spesifik enzim Poligalakturonase (Winarno, 1983) E. Rancangan Percobaan Rancangan dari penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan variasi kondisi proses fermentasi suhu dan ph sesuai dengan Tabel 3.2. Penelitian ini dilakukan dengan dua kali ulangan sampel dan satu kali ulangan analisis. Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan One Way Analyze of Variance (ANOVA) menggunakan aplikasi SPSS 16 untuk mengetahui ada atau tidaknya pengaruh pada tiap kondisi. Jika terdapat perbedaan yang signifikan, maka dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Range Test (DMRT). Semua analisis data dilakukan pada tingkat kepercayaan α= 5%. Tabel 3.2. Variasi Suhu dan ph Produksi Enzim Poligalakturonase Suhu ( o C) ph 5,0 6,0 7,0 45 C2 C3 C4 55 D2 D3 D4 65 E2 E3 E4