BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Penelitian Produk makanan olahan saat ini sedang berkembang di Indonesia. Banyaknya variasi bentuk produk makanan olahan, terutama berbahan dasar daging yang beredar di masyarakat harus diperhatikan. Akhir-akhir ini sering diberitakan di media massa, adanya campuran lain pada bahan baku produk tersebut seperti produk yang berbahan dasar daging sapi (Himawati, 2013). Sebagai negara yang mayoritas penduduknya beragama Islam, hal ini tentu saja menimbulkan keresahan di masyarakat karena menyangkut masalah kehalalan pangan. Fenomena yang terjadi dimasyarakat terkait perlindungan hak konsumen muslim adalah dengan ditemukannya cemaran daging babi pada produk makanan olahan, seperti dendeng, abon, sosis, dan bakso dengan tujuan untuk menghasilkan produk akhir dengan harga yang relatif murah dibandingkan jika menggunakan bahan aslinya (Rahmawati, 2012). Berdasarkan keterangan pers no. KH.00.01.1.53.1674 tanggal 16 April 2009 menyebutkan bahwa Badan POM RI telah melakukan sampling dan pengujian atas 35 merk dendeng/abon sapi (terdiri dari 15 dendeng dan 20 abon). Dari hasil pengujian tersebut ditemukan 5 (lima) dendeng positif DNA babi. Ke lima dendeng bermerk ini ditemukan di sejumlah pasar tradisional di Surabaya, Bandung, Jakarta, Semarang, Jambi, dan Bogor. Rahmawati (2012),juga telah mengungkapkan bahwa dua dari tujuh merk produk dendeng sapi yang beredar di wilayah Ciputat Jakarta mengandung DNA babi. 1
Berbagai metode analisis untuk mendeteksi adanya campuran daging babi telah banyak dilakukan diantaranya penggunaan teknik Electronic Nose (Che Man et al., 2009), analisis kandungan lemak babi dalam bakso sapi dilakukan dengan metode Fourier Transform-Infra Red (FT-IR) (Rohman et al., 2011), analisa kandungan daging babi pada produk daging yang telah diproses dengan pemanasan menggunakan metode enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) telah dilakukan oleh Chen and Hsieh (2000). Identifikasi DNA babi pada pada produk sosis, pembungkus sosis, roti dan biskuit dengan target spesifik 12S ribosomal RNA (rrna) dengan teknik PCR oleh Che Man et al. (2007), deteksi kontaminasi daging babi pada bakso dengan teknik restriction fragment length polymorphism (RFLP) PCR telah dilakukan oleh Raharjo et al. (2012). Dalam studi ini, DNA mitokondria (MtDNA) dipilih sebagai target pengujian, hal ini disebabkan karena MtDNA mempunyai jumlah cetak yang tinggi yaitu sekitar 100-10000 cetakan, sehingga dapat digunakan untuk analisis sampel dengan jumlah DNA yang sangat terbatas (Lelana et al., 2003). Primer yang didesain spesifik dari daerah MtDNA diantaranya D-Loop dan gen cytb yang digunakan untuk amplifikasi DNA babi pada kasus pencampuran daging sapi atau ayam dengan daging babi. Pengujian spesies dengan target spesifik DNA mitokondria gen cytb diantaranya untuk membedakan berbagai jenis spesies daging jenis mamalia (sapi, domba, babi) dan unggas (ayam dan kalkun) menggunakan pengujian TaqMan real time PCR telah dilakukan oleh Dooley et al. (2004).Pengujian spesies dengan target spesifik DNA mitokondria 2
D-Loop juga telah dikembangkan untuk membedakan beberapa spesies hewan, seperti ayam, bebek, burung, dan babi oleh Haunshi et al. (2009). Primer dengan target daerah DNA mitokondria D-Loop686 telah berhasil didesain oleh Himawati (2013) dengan panjang 20 bp untuk masing-masing primer Forward dan Reverse dengan panjang produk amplifikasi 114 dan 134 bp. Optimasi suhu annealing dan pengujian spesifitas primer D-Loop686 dengan metode real time PCR telah dilakukan pada beberapa gradien suhu dengan menggunakan sampel sediaan bakso dari dua jenis daging yaitu babi dan sapi (Himawati, 2013). Pada penelitian ini, optimasi suhu annealing dan pengujian spesifitas primer D-Loop686 hasil desain Himawati (2013) akan ditentukan dengan analisis real time PCR terhadap DNA babi diantara 4 jenis spesies lainnya yaitu sapi, ayam, kambing, dan kuda. Selanjutnya, metode real time PCR dengan primer D-Loop686 juga akan digunakan untuk mengidentifikasi cemaran DNA babi pada produk olahan daging dendeng dengan berbagai variasi konsentrasi penambahan daging babi. Disamping itu, dalam penelitian ini akan dilakukan verifikasi pengujian spesifitas primer DNA mitokondria gen cytb yang sudah tervalidasi dengan panjang produk amplifikasi 149 bp dalam mengidentifikasi DNA babi diantara empat jenis spesies lainnya (sapi, ayam, kambing, dan kuda) dan juga akan digunakan untuk mengidentifikasi cemaran DNA babi dalam campuran daging sapi pada produk olahan daging dendeng. Pengujian ini sekaligus untuk mengkonfirmasi hasil yang diperoleh dari pengujian spesifitas primer D-Loop686. Pada penelitian sebelumnya, primer gen cytb ini tidak menunjukkan primer dimer 3
dan memiliki spesifitas yang tinggi, ditunjukkan dengan kesamaan sekuen dari hasil BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) pada NCBI (national center for biotechnology information)database (Lampiran 1) dan tidak ada reaktifitas silang dengan DNA dari spesies lain (Dooley et al., 2004). Penelitian sebelumnya, primer DNA mitokondria gen cytb ini dengan metode real time PCR juga telah digunakan untuk mendeteksi dan mengkuantifikasi daging babi pada 17 sampel produk olahan daging unggas komersial oleh (Soares et al., 2013). Metode real time PCR dengan primer DNA mitokondria D-Loop686 dan gen cytb tersebut selanjutnya akan diaplikasikan pada produk dendeng komersial yang diperoleh dari beberapa supermarket dan pasar tradisional di Yogyakarta. a. Rumusan Masalah 1. Apakah primer D-Loop686 dengan metode real time PCR dapat mengidentifikasi secara spesifik DNA daging babi diantara empat jenis daging lainnya (sapi, ayam, kambing, dan kuda) dan pada produk dendeng campuran babi-sapi serta berapakah batas deteksi yang dapat diukur? 2. Bagaimanakah hasil verifikasi dari pengujian spesifitas dan sensitifitas dari primer gen cytb dengan metode real time PCR dalam mengidentifikasi DNA daging babi diantara empat jenis daging lainnya (sapi, ayam, kambing, dan kuda) dan pada produk dendeng campuran babi-sapi? b. Keaslian Penelitian Penelitian identifikasi daging babi dalam berbagai produk makanan berbahan daging telah banyak dilaporkan, dan teknik analisis PCR berdasarkan 4
amplifikasi DNA telah banyak dilakukan, diantaranya: pengembangan dan evaluasi suatu metode PCR yang spesifik dan sensitif dalam mengidentifikasi adanya daging babi pada produk olahan daging (sosis & hamburger) yang telah diproses dengan berbagai suhu pemanasan telah dilakukan oleh Calvo et al., (2001); pengembangan suatu metode deteksi kontaminasi daging babi, PCR yang cepat, sensitif dan spesifik pada berbagai produk makanan (sosis, roti, dan biskuit) dengan mengidentifikasi pita (band) hasil amplifikasi fragmen DNA mitokondria telah dilakukan oleh Che Man et al. (2007). Salah satu primer yang digunakan pada identifikasi spesies telah didesain dari fragmen mitokondria D-Loop babi. Sepasang primer D-Loop dengan panjang 20 bp (Forward primer: 5 -CACACCCTATAACGCCTTGC-3 ) dan 21 bp (Reverse primer: 5 -GATTGGCGTAAAAATCTAGGG-3 ) telah digunakan untuk mendeteksi adanya kontaminasi DNA daging babi pada daging segar, baik dalam bentuk tunggal maupun dalam bentuk campuran dengan jenis daging lainnya (Che Man et al., 2012). Dalam penelitian ini akan dikembangkan suatu metode analisis DNA real time PCR, yang mampu menunjukkan spesifisitas dan presisi yang baik serta mampu mendeteksi kontaminasi daging babi dengan konsentrasi terendah pada produk daging dendeng yang telah mengalami proses pengolahan dan pengeringan (70 0 C selama 3 jam) dari campuran daging babi dan sapi. Primer yang digunakan dalam penelitian ini berdasarkan hasil desain pada sekuen DNA mitokondria D-Loop686 babi; forward primer: 5 -GTTACGGGACATAACGTG CG-3 (20 bp) dan reverse primer: 5 -GGCAAGGCGTTATAGGGTGT-3 5
(20 bp) oleh Himawati (2013). Primer D-Loop686 ini akan diujikan spesifitasnya untuk membedakan daging babi diantara 4 spesies lainnya yaitu sapi, ayam, kambing, dan kuda. Metode real time PCR dengan primer D-Loop686 juga akan digunakan untuk mendeteksi cemaran daging babi pada produk olahan dendeng campuran daging sapi. Selanjutnya, untuk mengkonfirmasi hasil pengujian yang dilakukan, maka metode real time PCR menggunakan primer spesies spesifik DNA mitokondria gen cytb dengan urutan forward primer: 5 ATGAAACATTGGAGTAGTCCTACTATTTACC 3 (25 bp) dan revers primer: 5 -CTACGAGGTCTGTTCCGATATAAGG-3 (31 bp) dari Soares et al. (2013), juga akan digunakan. Metode ini, akan diaplikasikan dalam pengujian enam produk dendeng komersial yang beredar di Wilayah Yogyakarta. c. Urgensi Penelitian Penelitian ini diharapkan untuk mendapatkan metode spesifik dan sensitif yang dapat digunakan dalam mengidentifikasi cemaran daging babi pada produk daging olahan. Metode yang diperoleh tersebut untuk selanjutnya dapat digunakan dalam menentukan status kehalalan produk pangan yang beredar di pasaran guna menghindari pemalsuan daging dan sebagai dasar dalam memberikan sertifikasi Halal. 6
B. Tujuan Penelitian 1. Menentukan spesifitas primer D-Loop686 dengan metode real time PCR dalam mengidentifikasi DNA daging babi diantara empat jenis daging lainnya (sapi, ayam, kambing, dan kuda) dan pada produk dendeng campuran babi-sapi serta menentukan batas deteksi yang dapat diukur. 2. Menentukan hasil verifikasi dari pengujian spesifitas dan sensitifitas dari primer gen cytb dengan metode real time PCR dalam mengidentifikasi DNA daging babi diantara empat jenis daging lainnya (sapi, ayam, kambing, dan kuda) dan pada produk dendeng campuran babi-sapi. 7