14 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan dar i bulan Mei Agustus 2009 yang merupakan bagian dari penelitian Hibah Kemitraan Studi Efikasi Makanan Fungsional Berbasis Tepung Ikan dan Probiotik untuk Meningkatkan Daya Tahan Tubuh Anak Balita Rawan Gizi. Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobologi, Institut Teknologi Indonesia (ITI) Serpong untuk pembuatan krim. Analisis sifat fisik dan kimia krim dilakukan di Laboratorium Kimia dan Analisis Pangan, Departemen Gizi Masyarakat, Institut Pertanian Bogor. Pemeliharaan dan perlakuan pada tikus, serta pengukuran berat badan tikus dilakukan di Laboratorium Hewan-Pusat Penelitian dan Pengembangan Gizi dan Makanan, Departemen Kesehatan, Bogor. Analisis mikrobiologi krim dan analisis profil mikrobiota fekal tikus dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, SEAFAST, Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah bahan untuk pembuatan krim (mentega, susu, gula bubuk, margarin), Enterococcus faecium IS-27526 dengan viabilitas probiotik adalah 10 8 cfu/g krim, tikus jantan jenis Sprague Dauley, ransum, bahan untuk analisis sifat fisik dan kimia (HCl 0,1 M, NaOH 0,1 M, ZnSO 4 5%, Ba(OH) 2 0,3 N, kertas saring, K 2 SO 4, H 2 SO 4, H 3 BO 3, Na 2 S 2 O 3, metilen biru, alkohol), dan analisis mikrobiologi (MRSA, PCA, PDA, VRBA, dan buffer fosfat). Peralatan yang digunakan dalam penelitian adalah alat-alat untuk proses pembuatan krim probiotik, alat untuk analisis sifat fisik, kimia dan mikrobiologi, seperti autoklaf, inkubator, oven, neraca analitik, refrigerator, vakum flash, timbangan, desikator, Bunsen, gelas ukur, cawan petri, cawan porselin, tabung silinder kimia, tabung Soxhlet, labu Kjeldahl, labu takar, pipet tetes, Erlenmeyer, hotplate, laminar, vorteks, mikropipet, cryotube, tabung reaksi, rak tabung, serta alat-alat pemeliharaan tikus, yaitu kandang tikus, timbangan, tempat makan, dan tempat minum.
15 Metode Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental dengan percobaan hewan di laboratorium. Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap, yaitu modifikasi produk krim probiotik yang telah dimikroenkapsulasi, analisis sifat fisik krim probiotik dan krim non probiotik, analisis sifat kimia krim probiotik dan krim non probiotik, analisis mikrobiologi krim probiotik dan krim non probiotik, serta percobaan hewan untuk menganalisis pengaruh pemberian perlakuan terhadap perubahan berat badan tikus, bakteri asam laktat fekal tikus dan bakteri koliform fekal tikus. Modifikasi Pembuatan Krim Probiotik Formula dasar yang digunakan dalam pembuatan krim probiotik mengacu pada has il penelitian Rieuwpassa (2004). Probiotik yang digunakan dalam penelitian ini adalah E. faecium IS-27526 yang telah terbukti, baik secara in vitro maupun in vivo. E. faecium IS-27526 telah memenuhi syarat bakteri dinyatakan sebagai probiotik yaitu aman dikonsumsi atau tergolong GRAS, secara in vitro tahan asam, garam empedu dan lisozim, memiliki kemampuan menempel dan berkolonisasi yang cukup baik dan mampu berkompetisi dengan patogen sehingga dapat dimanfaatkan untuk menjaga kesehatan dan ketahanan tubuh (Surono 2003). Modifikasi yang dilakukan berupa penambahan probiotik E. faecium IS- 27526 yang telah dimikroenkapsulasi dengan menggunakan metode FBD yang bertujuan untuk mempertahankan viabilitas probiotik dari lingkungan yang ekstrim saat melewati saluran pencernaan dan disaat penyimpanan. Proses penyalutan dilakukan dengan metode suspensi udara. Pada proses fluidisasi, partikel padat akan mengalir ke atas melalui bagian yang disebut bed dan ketika laju aliran gas mencapai titik kritis (laju fluidisasi minimum), maka partikel padat akan tersuspensi secara merata. Modifikasi juga dilakukan karena probiotik dalam bentuk serbuk bila disimpan pada suhu ruang viabilitasnya akan menurun dalam waktu relatif singkat. Pada penelitian ini, dalam satu biskuit berkrim mengandung 10 8 cfu/g probiotik E. faecium IS-27526 pada formula krim. Komposisi (formula dasar) krim has il penelitian Rieuwpassa (2004) dapat dilihat pada Tabel 2. Persiapan
16 krim probiotik dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, Institut Teknologi Indonesia, Serpong. Tabel 2 Komposisi krim Komponen Jumlah Mentega (unsalted) 10 g Margarin 10 g Gula halus 75 g Susu cair 5 ml Analisis Sifat Fisik dan Kimia Krim Analisis sifat fisik krim yang dilakukan meliputi ph dan densitas kamba. Metode analisis secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 1. Sifat kimia krim yang dianalisis meliputi kadar air, protein, lemak, abu dan karbohidrat. Metode analisis secara lengkap disajikan pada Lampiran 2. Analisis Mikrobiologi Krim Analisis mikrobiologi yang dilakukan untuk menguji krim probiotik dan krim non probiotik meliputi total bakteri asam laktat (BAL), total mikroba (TPC), serta total kapang dan khamir. Masing-masing analisis menggunakan media kultur deman Rogosa Sharpe Agar (MRSA), Plate Count Agar (PCA), Potato Dextrosa Agar (PDA) sebagai medium pertumbuhan dan dilakukan pengenceran sesuai keperluan. Setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan petri dalam jumlah yang dapat dihitung. Perhitungan koloni yang ditumbuhkan dilakukan berdasarkan Standard Plate Count dengan jumlah terbaik. Cara kerja selengkapnya diuraikan pada Lampiran 3. Percobaan pada Hewan Penelitian selanjutnya adalah pemberian krim dan biskuit kepada tikus melalui beberapa perlakuan. Masing-masing tikus mendapatkan biskuit sebanyak 2,3 g/hari dan krim 0,7 g/hari, lalu ditambahkan ke dalam ransum standar. Dasar pertimbangan pemberian biskuit dan krim pada tikus berdasarkan konsep pemberian makanan tambahan (PMT) yang dianalogkan pada balita, yaitu sekitar 10 25% kalori. Hal ini dapat dikaitkan dengan kandungan gizi yang terdapat di
17 dalam biskuit tinggi protein yang memberikan sumbangan 490,03 kkal energi dan 22,60 g protein per 100 g biskuit, sehingga diharapkan dengan mengkonsumsi 50 g biskuit yang terdiri dari 4 keping biskuit, dapat memberikan kontribusi asupan protein lebih dari 20% (analog ke balita). Selain itu, dengan adanya probiotik di dalam krim dapat membantu meningkatkan kesehatan saluran pencernaan sehingga penyerapan zat gizi dapat berlangsung lebih baik. Penelitian ini menggunakan hewan sebanyak 30 ekor tikus jantan jenis Sprague Dauley dengan syarat sehat, lepas sapih (30 hari) dengan rata-rata berat badan berkisar 60 g. Tikus ditempatkan pada kandang per individu dan diadaptasikan selama 5 hari dengan memberikan ransum standar. Pemberian ransum standar dilakukan setiap hari. Komposisi dan cara pembuatan ransum dapat dilihat pada Lampiran 4. Setelah lima hari adaptasi tikus ditimbang dan berat badan diurutkan (rata-rata variasi berat badan antar kelompok kurang lebih 5 g dan variasi berat badan dalam satu kelompok kurang lebih 10 g). Jenis tikus serta kandang yang digunakan dapat dilihat pada Gambar 1. Gambar 1 Tikus percobaan dan kandang Kemudian dilakukan pemeriksaan berat badan tikus, analisis bakteri asam laktat fekal tikus dan bakteri koliform fekal tikus guna memperoleh data awal setelah 5 hari masa adaptasi. Tikus dikelompokkan secara acak ke dalam enam kelompok perlakuan, yaitu kontrol negatif / ransum standar (A0); kontrol positif / ransum standar + krim non probiotik + biskuit biasa (A1); ransum standar + krim probiotik + biskuit tinggi protein (A2); ransum standar + krim probiotik + biskuit tinggi protein (selang 2 hari) (A3); ransum standar + krim probiotik + biskuit biasa (A4) dan ransum standar + krim non probiotik + biskuit tinggi protein (A5).
18 Pemberian krim probiotik + biskuit tinggi protein (selang 2 hari) (A3) dilakukan untuk melihat keberadaan perbedaan antar perlakuan tentang efek yang diberikan terhadap berat badan tikus, bakteri asam laktat fekal tikus dan bakteri koliform fekal tikus. Selain itu, pemberian selang 2 hari dilakukan untuk mengoptimalisasi biaya karena hasil penelitian ini akan menjadi rekomendasi program intervensi pada balita gizi kurang di Sukabumi. Pengelompokan tikus berdasarkan jenis perlakuan disajikan pada Tabel 3. Tabel 3 Pengelompokan tikus berdasarkan jenis perlakuan Kelompok A0 A1 A2 A3 A4 A5 Perlakuan Kontrol negatif / ransum standar Kontrol positif / ransum standar + krim non probiotik+ biskuit biasa Ransum standar + krim probiotik + biskuit tinggi protein Ransum standar + krim probiotik + biskuit tinggi protein (selang 2 hari) Ransum standar + krim probiotik + biskuit biasa Ransum standar + krim non probiotik + biskuit tinggi protein Sebanyak 30 ekor tikus, kemudian memasuki masa perlakuan selama 21 hari. Selama perlakuan berlangsung, berat badan tikus ditimbang setiap 2 hari sekali, analisis bakteri asam laktat fekal tikus dan bakteri koliform fekal tikus dilakukan pada hari ke-0 (data awal), 7 hari, 14 hari, dan 21 hari intervensi. Skema alur penelitian dapat dilihat pada Gambar 2.
19 30 Ekor tikus jantan Sprague Dauley Adaptasi 5 hari Penimbangan berat badan tikus awal (hari ke-0) Analisis BAL fekal tikus awal (hari ke-0) Analisis bakteri koliform fekal tikus awal (hari ke-0) Kontrol negatif (ransum standar) (A0) Kontrol positif (ransum standar + krim non probiotik + biskuit biasa) (A1) Ransum standar + krim probiotik + biskuit tinggi protein (A2) Ransum standar + krim probiotik + biskuit tinggi protein (selang 2 hari) (A3) Ransum standar + krim probiotik + biskuit biasa (A4) Ransum standar + krim non probiotik + biskuit tinggi protein (A5) Penimbangan berat badan tikus setiap 2 hari sekali Analisis bakteri asam laktat fekal tikus hari ke-7, 14, dan 21 Analisis bakteri koliform fekal tikus hari ke-7, 14, dan 21 Gambar 2 Skema alur penelitian
20 Analisis ketahanan mikrobiota fekal tikus dilakukan dengan menghitung total bakteri asam laktat fekal tikus dan total bakteri koliform fekal tikus. Pemupukan dilakukan dengan menggunakan media yang sesuai dengan bakteri yang akan diamati yaitu bakteri asam laktat menggunakan media MRSA yang diberi indikator bromocresol purple, dengan menghitung koloni yang tumbuh berwarna kuning dan tetap kuning setelah lebih dari 48 jam inkubasi, bakteri koliform menggunakan VRBA dengan koloni bakteri Escherichia coli tumbuh berwarna merah kehijauan dengan kilat metalik atau koloni berwarna merah muda dengan lendir untuk kelompok koliform lainnya. Cara kerja selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 5. Rancangan Percobaan dan Analisis Data Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL). Model matematika rancangan adalah sebagai berikut: Yij = µ + ai + eij Dimana : Yij = Variabel yang dianalisis µ = Pengaruh rata-rata yang sebenarnya ai = Efek perlakuan ke-i eij = Efek pengacakan unit j dari perlakuan ke-i Pengamatan dan Analisis Data Data analisis sifat fisik dan sifat kimia krim dianalisis dengan menggunakan t-test untuk mengetahui perbedaan antara krim probiotik dan krim non probiotik, analisis mikrobiologi krim ditabulasi dan disajikan secara deskriptif, pengaruh perlakuan terhadap perubahan berat badan tikus, bakteri asam laktat fekal tikus dan bakteri koliform fekal tikus dianalisis secara statistik dengan menggunakan Analysis of Variance (ANOVA). Analisis statistik dilakukan pada masing-masing parameter pengamatan (berat badan tikus, bakteri asam laktat fekal tikus dan bakteri koliform fekal tikus) sesuai dengan hari pengamatan. Jika terdapat pengaruh yang nyata, maka akan dilanjutkan dengan uji Tukey.