4 II. MATERI DAN METODE PENELITIAN A. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian 1. Materi Penelitian 1.1. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat murni kultur P. ostreatus strain Purwokerto, tubuh buah dan filtrat kultur P. ostreatus, isolat bakteri S. typhidan B. cereus, etil asetat, medium Fermentasi Cair (FC) 1, 2, 3, serbuk gergaji kayu, bekatul, gypsum, kalsium karbonat, tepung jagung, medium Potato Dextrose Agar (PDA), medium Nutrient Agar (NA), medium Nutrient Broth (NB), Dymetyl Sulfoxside (DMSO) 5%, cakram kertas, kertas saring, wrapper,plastik polipropilen, kertas label, dan akuades (Lampiran 8). 1.2. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah labu Buchner, corong Buchner, laminar air flow,gelas ukur, gelas beaker, labu Erlenmeyer, oven, autoklaf, hot plate& stirrer, blender, cawan petri, Drugalsky,shaker orbital, tabung reaksi, rak tabung, pinset, mikropipet, tip, Incubator, rotary evaporator, jarum ose, bor gabus, ph meter, timbangan analitik, dan pompa vakum (Lampiran 9). 2. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian inidilakukan di Laboratorium Mikologi dan Fitopatologi Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman.Penelitian ini dilaksanakan selama 7 bulan, dimulai pada bulan Februari2014 sampai bulan Agustus 2014. B. Metode Penelitian 1. Rancangan Percobaan Penelitian dilakukan secara eksperimental denganmenggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL), dengan perlakuan ekstrak antimikroba dari tubuh buah dan filtrat kulturp. ostreatus pada medium berbeda yang diujikan terhadap bakteri S. typhi dan B. cereus secara terpisah. Perlakuan terdiri atas: TB 0 % : Ekstrak tubuh buah dari medium yang ditambahkan tepung jagung 0%
5 TB 1 % : Ekstrak tubuh buah dari medium yang ditambahkan tepung jagung 1% TB 2 % : Ekstrak tubuh buah dari medium yang ditambahkan tepung jagung 2% TB 3 % : Ekstrak tubuh buah dari medium yang ditambahkan tepung jagung 3% FC 1 : Ekstrak filtrat dari medium FC1 FC 2 : Ekstrak filtrat dari medium FC2 FC 3 : Ekstrak filtrat dari medium FC3 Keterangan : FC 1 =komposisi medium FC 1 terdiri atas(g/l) kentang 200,0; dekstrosa 20,0; ekstrak biji jagung10,0. FC 2 =komposisi medium FC 2 (g/l) glukosa 20,0; pepton 5,0; ekstrak yeast 2,0; KH 2 PO 4 1,0; MgSO 4. 7H 2 O 0,5; dan NaCl 0,06; MnCl 2 4H 2 O 0.4; ZnCl 2 0.2; FeCl 3 6H 2 O 0.8; CuSO 4 5H 2 O 0.1. FC 3 = komposisi medium FC 3 (g/l) glukosa 40,0; pepton 1,0; ekstrak yeast 2,0; KH 2 PO 4 1,0; MgSO 4. 7H 2 O 0,2; (NH 4 )SO 4 5,0. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 4 kali sehingga terdapat 28 unit perlakuan. 2. Variabel dan Parameter Penelitian Variabel yang digunakan dalam penelitian ini ada 2 macam yaitu variabel bebas dan variabel tergantung. Variabel bebas adalahekstrak P. ostreatus yang digunakan sedangkan variabel tergantung adalah aktivitas penghambatan pada bakteri uji. Parameter utama yang diamati meliputi diameter zona hambat bakteri, sedangkan nilai MIC, bobot ekstrak diamati sebagai parameter pendukung. 3. Cara Kerja 3.1. Pembuatan Medium Padat (Oyetayo, 2012) Medium utama terdiri atas serbuk gergaji kayu 100kg + bekatul 15kg + gypsum 1kg + kalsium karbonat 5kg + TSP 1kg untuk satu resep yang ditambahkan tepung jagung masing-masing dengan konsentrasi 0%, 1%, 2%, dan 3%, kemudian dimasukkan dalam plastik polipropilen (bobot kompos 600 gra m), disterilisasi dan diinokulasi dengan bibit P. ostreatus, diinkubasikan selama 28 hari. Setelah 28 hari tutup plastik dibuka dan tubuh buah yang pertama terbentuk dipanen.
6 3.2. Pembuatan Medium Medium yang digunakan adalah medium PDA, NA, dan NB dengan komposisi dan cara pembuatan terlampir dalam lampiran 2. 3.3. Peremajaan Isolat P. ostreatus (Vamanu, 2013) Biakan murni P. ostreatus dipotong dengan bor gabus, kemudian diinokulasikan kedalammedium PDA dan diinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari sampai miselium memenuhi cawan. 3.4. Pembuatan Medium Cair (Ekowati et al.,2011) Medium cair yang digunakan untuk produksi filtrat kultur adalah FC1, FC 2, dan FC 3 dengan komposisi dan cara pembuatan medium terlampir dalam Lampiran 2. 3.5. Kultivasi P. ostreatus pada Medium Cair (Ekowati et al.,2011) Erlenmeyer Masing-masingmedium sesuai perlakuan (FC 1, 2, 3) ditempatkan dalam labu sebanyak 100 ml, kemudian diinokulasikan koloni P. ostreatus yang telah dipotong dengan bor gabus diameter 5 mm. Medium yang telah diinokulasi tersebut diinkubasikan pada shaker orbital dengan kecepatan sebesar 100 rpm selama 28 hari. 3.6. Produksi dan Ekstraksi Senyawa Antimikroba dari Filtrat Kultur P. ostreatus (Ekowati et al.,2011) Filtrat kultur P. ostreatusdari medium FC 1, 2, 3 dipisahkan dari miselium menggunakan pompa vakum. Sebanyak 50 ml filtrat kultur dimasukkan dalam corong pemisah dan ditambah 25 ml etil asetat, digojog dengan kedua tangan selama 10 menit, kemudian corong pemisah dipasang pada statif dan didiamkan selama 5 menit sampai terjadi pemisahan antara etil asetat dan filtrat. Etil asetat akan berada pada lapisan atas kemudian dipisahkan, ditampung pada labu Erlenmeyer. Proses ekstraksi dengan etil asetat dilakukan dua kali berturut-turut. Ekstrak senyawa antimikrobadiperoleh dengan penguapan etil asetat menggunakan rotary evaporator pada suhu 45 0 C.Ekstrak disimpan pada suhu 4 0 C sampai digunakan. 3.7. Produksi dan Ekstraksi Senyawa Antimikroba dari Tubuh Buah P. ostreatus (Akyuz, 2010) Tubuh buah dikeringkan menggunakan oven suhu 50 0 C, kemudian dihaluskan sampai menjadi serbuk. Sebanyak 5 gram serbuk tubuh buah diekstraksimenggunakan 25 ml etil asetat dan dikocok menggunakan shaker orbital selama 24 jam. Ekstrak etil asetat disaring menggunakan kertas saring, kemudian serbuk tubuh buah yang sudah dipisahkan diekstraksi kembali dengan 25 ml etil
7 asetat. Ekstrak etil asetat dari ekstraksi pertama dan kedua dicampur, pelarutnya diuapkan dengan rotary evaporator.ekstrak kering yang sudah diperoleh selanjutnya disimpan pada suhu 4 0 C sampai digunakan. 3.8. Uji Aktivitas Senyawa AntimikrobaP. ostreatus terhadap Pertumbuhan S. typhi dan B. cereus dengan Metode Difusi Agar (Akyuz, 2010) Isolat S. typhidanb. cereuscair dengan kepadatan 10 8 CFU s/ml sebanyak 0,1 ml ditumbuhkan dengan metode Spread Plate (SP) pada medium NA. Ekstrak tubuh buah dan filtrat kultur P. ostreatusdiencerkan dengan DMSO 5%. Ekstrak tubuh buah dan filtrat P. ostreatussebanyak 50 µl diteteskan pada kertas cakram dengan diameter 5 mm. Kertas cakram yang sudah diberi ekstrak tubuh buah dan filtrat P. ostreatusdiletakkan pada medium NA yang telah diinokulasikan bakteri uji dan diinkubasi pada suhu 4 0 C selama 2 jam, kemudian dilakukan inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0 C. Daya antimikroba digambarkan oleh zona hambat pertumbuhan mikroba uji yang dinyatakan dengan ukuran diameter zona jernih. Zona hambatnya diamati dengan menghitung (D1+D2+D3+D4)/4 Keterangan: D1 : Diameter 1 D2 : Diameter 2 D3 : Diameter 3 D4 : Diameter 4 3.9. Uji MIC dengan Metode Dilusi (Dilution Methods) (Iwalokun, 2007) Ekstrak kultur P. ostreatus yang memiliki zona hambat paling besar digunakan untuk uji MIC yang ditentukan dengan menggunakan metode dilusi. Ekstrak kultur P. ostreatus ditimbang sebanyak 200 mg dan dilarutkan dalam 100 µl DMSO sebagai larutan stok divortex selama satu menit. Larutan tersebut diencerkan dengan seri pengenceran dari 1000 µg/ml sampai 200 µg/mldengan interval 200 µg/ml yang dilarutkan dalam medium Nutrient Broth (NB). Sebanyak 1 ml larutan ekstrak dari masing-masing konsentrasi ditambahkan pada tabung yang berisi medium NB, kemudian sebanyak 0,1 ml suspensi bakteri dengan kepadatan sel 10 8 CFU s/ml diinokulasikan ke dalam tabung kemudian divortex selama satu menit. Masing-masing tabung diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam, kemudian ditumbuhkan dengan metode Pour Plate (PP) pada medium NA dan diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37 0 C. Jumlah bakteri yang tumbuh dihitung menggunakan metode Total Plate Count (TPC) dengan rumus, CFU s/ml = jumlah kolonix 1/faktor pengenceran X 1/PP
8 Nilai MIC ditunjukkan dengan pertumbuhan bakteri uji yang paling sedikit dari konsentrasi yang paling rendah. C. Metode Analisis Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam (ANOVA), dan perbedaan nyata antar perlakuan dianalisis dengan uji Duncan pada tingkat kepercayaan 95%.