42 BAB IV METODE PENELITIAN 4.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini menggunakan dua rancangan penelitian, yaitu: deskriptif eksploratif dan eksperimental. Penelitian deskriptif eksploratif meliputi isolasi dan identifikasi, sedangkan penelitian eksperimental meliputi uji toksisitas dan aktivitas antikanker. Adapun tahapan dari penelitian ini yaitu: penyiapan bahan, ekstraksi dan pemisahan, identifikasi senyawa toksik dengan menggunakan uji fitokimia dan GC-MS, serta uji aktivitas antikanker. 4.2 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei-September 2014 bertempat di Laboratorium Pengembangan Sumberdaya Genetik Kelautan dan Rekayasa Genetik Universitas Udayana. Uji antikanker terhadap sel HeLa dilakukan di Laboratorium Pusat Studi Satwa Primata Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat Institut Pertanian Bogor dan analisis GC-MS dilakukan di Laboratorium Bersama FMIPA Universitas Udayana. 4.3 Bahan dan Peralatan Penelitian 4.3.1 Bahan penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah spons genus Haliclona Grant, 1836 yang diperoleh dari perairan Sanur Bali. Identifikasi sampel spons 42
43 dilakukan di Laboratorium Sistematika Hewan, Fakultas Biologi, Universitas Gajah Mada. Penyiapan bahan meliputi pengumpulan bahan, pembersihan dan pemotongan bahan. Bahan biologi sebagai uji toksisitas adalah larva Artemia salina Leach, bahan untuk uji antikanker menggunakan sel kanker serviks (human servical cell line), HeLa. 4.3.2 Bahan kimia Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah dalam derajat p.a dan teknis yang telah didestilasi seperti: metanol, etanol, n-heksana, etilasetat, kloroform, silika gel GF 254, silika gel 60, DMSO, kalsium klorida anhidrat (CaCl 2 ), asam asetat glasial, asam formiat, aseton. NaOH 10%, asam sulfat pekat, asam klorida pekat dan 2 N, benzena, pereaksi Liebermann- Burchard, pereaksi Dragendorff, pereaksi Meyer, natrium klorida, etanol 95%. 4.3.3 Alat penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat gelas, neraca analitik, blender, pisau, penguap putar vakum, lampu UV, seperangkat alat kromatografi lapis tipis dan kolom, desikator, tabung reaksi, plat tetes, bak kaca/akuarium, plastik hitam, pipet tetes, pipet mikro dengan berbagai ukuran, multiwall plate (96 well), culture flask (25 cm), culture flask (75 cm), pippetes tip (1 ml), pippetes tip (10 ml), kertas saring, dan seperangkat alat GC-MS-QP2010 Ultra Shimadzu.
44 4.4 Prosedur Penelitian 4.4.1 Pengambilan sampel spons Sampel spons Haliclona Grant, 1836 diperoleh dari pantai Semawang, Sanur, Bali. Pengambilan sampel spons menggunakan teknik purposive sampling, yaitu teknik penentuan sampel dengan pertimbangan tertentu. Pengambilan sampel dilakukan dengan maksud atau tujuan tertentu. Sebagian tubuh spons yang diperoleh dipotong menggunakan pisau dan sampel yang didapat segera dimasukkan ke dalam botol polietilen. Selanjutnya ditambahkan alkohol 96 % hingga sampel terendam. Kemudian botol polietilen tersebut dimasukkan ke dalam plastik sampel berwarna gelap. 4.4.2 Uji pendahuluan 4.4.2.1 Penyiapan ekstrak Spons genus Haliclona Grant, 1836 masing-masing 100 gram diekstraksi secara maserasi dengan 100 ml etanol dan 100 ml metanol. Filtrat etanol dan metanol disaring dan diuapkan dengan penguap putar vakum sehingga menghasilkan ekstrak kasar (crude extract) yang kering. Ekstrak kasar selanjutnya diuji toksisitasnya menggunakan larva Artemia salina Leach. 4.4.2.2 Uji toksisitas Uji toksisitas dengan larva Artemia salina Leach mengikuti metode Meyer (1982). Media untuk larva dibuat dengan menyaring air laut secukupnya. Air laut dimasukkan dalam akuarium yang dibagi menjadi dua bagian, yaitu satu bagian dibuat gelap dengan cara ditutup dengan kertas hitam dan bagian yang lain dibiarkan terbuka. Sebanyak 50 mg telur Artemia salina Leach diletakkan atau
45 direndam pada bagian yang gelap dan dibiarkan selama 48 jam sampai menetas menjadi benur (larva) yang matang dan siap digunakan untuk pengujian. Telur akan menetas dan akan bergerak secara alamiah menuju daerah terang sehingga larva terpisah dari kulit telur. Dua puluh miligram ekstrak dilarutkan dengan 2 ml pelarut. Larutan diambil sebanyak 500 µl, 50 µl dan 5 µl, kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan pelarutnya diuapkan. 50 µl dimetilsulfoksida, 1 ml air laut, dan 10 ekor larva dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang pelarutnya telah diuapkan. Air laut ditambahkan ke dalam tabung sampai volumenya 5 ml sehingga dicapai konsentrasi ekstrak 1000 ppm, 100 ppm, dan 10 ppm (Perhitungan pembuatan larutan uji toksisitas disajikan pada Lampiran 2). Konsentrasi 0 ppm juga dibuat sebagai kontrol tanpa penambahan ekstrak. Masing-masing tabung reaksi ditutup dengan aluminium foil yang berlubang kecil-kecil. Setelah 24 jam, dilakukan pengamatan terhadap kematian larva Artemia salina Leach. Kriteria standar untuk menilai kematian larva adalah bila larva Artemia salina Leach tidak menunjukkan pergerakan selama beberapa detik observasi (Carballo, 2002). Jumlah larva yang hidup dan yang mati dicatat, kemudian dilakukan analisis data untuk mencari konsentrasi kematian (LC 50 ). Efek toksik diperoleh dari pengamatan dengan menghitung % mortalitas larva Artemia salina Leach pada tiap konsentrasi. Jumlah larva yang mati dalam tiap vial selama 24 jam dihitung. Persen mortalitas diperoleh dari hasil perkalian rasio dengan 100 %, yaitu larva yang mati dibagi jumlah larva awal dikali 100 %
46 untuk tiap replikasi. Lalu dibandingkan dengan kontrol dan dilakukan analisis hasil sehingga diperoleh harga LC 50. % mortalitas = jumla h larva mati jumla h larva total awal 100 % Dari persen mortalitas bioindikator, kemudian dibuat grafik antara % mortalitas vs log konsentrasi, dan diperoleh garis lurus dengan persamaan: y = mx + b. Nilai LC 50 diperoleh dari anti log konsentrasi, dengan x merupakan logaritma konsentrasi bahan toksik pada y = 50, yaitu nilai 50 % bioindikator, sehingga persamaan regresi menjadi: x = 50 b m dengan nilai m dan b diperoleh berdasarkan persamaan berikut: m = xy 1 ( x y ) n x 2 1 n ( x)2 b = 1 ( y m x) n Keterangan: y x b m : nilai persen mortalitas : logaritma konsentrasi bahan uji : konstanta : slope/kemiringan
47 4.4.3 Isolasi metabolit sekunder 4.4.3.1 Ekstraksi metabolit sekunder Spons genus Haliclona Grant, 1836 sebanyak 3000 gram diekstraksi secara maserasi dengan 5 L metanol sampai terendam. Setiap 24 jam filtratnya disaring dan ampasnya dimaserasi lagi dengan metanol. Ekstraksi dilakukan selama 3 hari dan diperkirakan semua metabolit terekstrak. Semua filtrat metanol diuapkan menggunakan penguap putar vakum sampai menghasilkan ekstrak kasar metanol. Ekstrak kasar metanol dilarutkan dalam 250 ml air., selanjutnya dipartisi dengan n-heksana (5 x 50 ml). Ekstrak n-heksana (EH) dikumpulkan dan residunya dipartisi dengan kloroform (5 x 50 ml). Ekstrak kloroform (EK) dan ekstrak air (EA) dikumpulkan. Ketiga ekstrak (EH, EK dan EA) diuapkan menggunakan pemutar putar vakum sehingga diperoleh ekstrak kental EH, EK dan EA. 4.4.3.2 Uji toksisitas ekstrak hasil partisi Ketiga ekstrak kental (EH, EK dan EA) diuji toksisitasnya menggunakan cara seperti 4.4.2.2. Ekstrak yang memperlihatkan toksisitas paling tinggi selanjutnya dipisahkan dan dimurnikan. 4.4.3.3 Pemisahan dan pemurnian metabolit sekunder Pemisahan metabolit akan menggunakan metode kromatografi kolom dengan fase diam silika gel 60 (70 230 mesh ASTM) dengan eluen terbaik hasil kromatografi lapis tipis (KLT).
48 a. Kromatografi lapis tipis Fasa diam yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis adalah silika gel 60 GF 254. Pemilihan fasa gerak yang dipakai didasarkan dengan cara mencobacoba berbagai sistem pelarut dengan prinsip like dissolves like (perbedaan tingkat kepolaran). Sebanyak 0,2 mg sampel dilarutkan dengan pelarutnya kemudian ditotolkan pada jarak 1 cm dari bagian bawah plat KLT. Setelah itu dibiarkan beberapa saat hingga kering. Plat KLT yang mengandung sampel dielusi dengan cara dimasukkan ke dalam bejana kromatografi secara vertikal dengan dasar plat tersebut tercelup pada sistem pelarutnya dan titik sampel sedikit di atas larutan pengembang. Sebelumnya bejana kromatografi ini sudah dijenuhkan dengan uap dari pengembang. Elusi dilakukan dalam ruangan tertutup dan dihentikan setelah fasa gerak mencapai garis batas yang telah ditentukan. Plat KLT diambil dari bejana kromatografi dan dikeringkan di udara terbuka. Pemisahan komponen dalam sampel dapat diamati dibawah lampu UV pada panjang gelombang 254 nm atau 366 nm. Selain itu dapat juga digunakan uap iodin atau menyemprot plat KLT menggunakan pereaksi pendeteksi noda. Fase gerak yang memberikan jumlah noda yang paling banyak dengan jarak pemisahan yang bagus selanjutnya akan dipilih sebagai eluen dalam analisis kromatografi kolom. b. Kromatografi kolom Pemisahan dengan teknik kromatografi kolom dilakukan dengan menggunakan fasa diam silika gel (70-230 mesh ASTM) dan fasa geraknya menggunakan eluen terbaik hasil analisis kromatografi lapis tipis. Kolom terlebih
49 dahulu disumbat longgar dengan kapas atau glass wol. Setelah itu diawali dengan pembuatan kolom, dimana eluen ditambahkan ke silika gel sehingga menjadi bubur. Eluen dimasukkan ke dalam kolom dengan kran kolom dalam keadaan tertutup. Setelah itu kran kolom dibuka dan aliran eluen diatur kecepatannya kemudian bubur sedikit demi sedikit dimasukkan ke dalam kolom dengan hatihati agar tidak terbentuk gelembung udara di dalam kolom. Bila semua bubur telah masuk, eluen tetap dialirkan dan dijaga agar bubur tidak kering atau pecah. Kolom dielusi terus dengan eluennya sampai kolom homogen. Setelah kolom diperkirakan homogen maka eluen ditambahkan pada 1,5 gram sampel sampai larut. Kemudian dimasukkan ke dalam kolom dengan hatihati sambil kran dibuka dengan kecepatan alir 1 ml/menit. Eluen secara terusmenerus dialirkan ke dalam kolom sampai terjadi pemisahan. Eluat ditampung setiap 3 ml dalam botol penampung. Elusi dihentikan setelah diperkirakan semua komponen keluar dari kolom. Setiap botol eluat dilihat pola nodanya pada plat kromatografi lapis tipis. Eluat yang memiliki pola pemisahan noda yang sama digabungkan sehingga diperoleh beberapa fraksi. Fraksi-fraksi yang diperoleh diuji toksisitasnya. Fraksi yang paling toksik akan diuji kemurniannya. c. Uji kemurnian Uji kemurnian dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis pada beberapa campuran fase gerak. Jika isolat tetap menunjukkan noda tunggal pada plat KLT dengan fase gerak yang berbeda maka isolat tersebut sudah relatif murni (murni secara KLT) dan akan dilakukan uji antikanker terhadap sel Hela dan dianalisis senyawanya.
50 4.4.4 Uji antikanker secara in vitro terhadap Sel HeLa Sel HeLa dikultur pada media DMEM, FBS 10 %, 100 µg/ml dan streptomycin 100 µg/ml dan dihitung jumlah sel awal di bawah mikroskop. Sel diinkubasi dalam inkubator suhu 37 0 C, 5 % CO 2. Kemudian sel dipanen dengan penambahan tripsin. Selanjutnya sampel disentrifugasi hingga terbentuk dua lapisan yaitu endapan dan supernatan. Supernatannya dibuang, sedangkan endapan dibentuk pelet dan ditambahkan media pertumbuhan baru. Setelah sel mencukupi, sel ditanam pada 96 multi-well plate. Tiap sumuran berisi 5 x 10 3 sel dalam 100 µl media DMEM. Inkubasi sel selama 1-2 jam hingga sel melekat. Selanjutnya sebanyak 100 µl ekstrak sampel dengan berbagai konsentrasi ditambahkan pada setiap well, jadi total setiap well berisi 200 µl. Sumuran yang hanya berisi media DMEN sebagai kontrol media, sedangkan sumuran yang mengandung media DMEM dan sel komplit tanpa ekstrak sebagai kontrol sel. Inkubasi dalam inkubator CO 2 5% selama 24 jam pada suhu 37 0 C. Setelah 24 jam sel dilihat di bawah mikroskop. MTT sebanyak 10 µl dengan konsentrasi 5 mg/ml ditambahkan pada masing-masing well. Inkubasi kembali selama 4 jam sampai terbentuk formazan. Reaksi MTT dihentikan dengan cara menambahkan SDS 50 µl sebagai stop solution, diinkubasi kembali dalam ruang gelap selama 12 jam. Formazan dielusikan dari sel dengan 150 µl DMSO. Pembacaan absorbansi dilakukan dengan ELISA microplate reader pada panjang gelombang 595 nm. Pada metode MTT, persentase daya hambat terhadap sel HeLa dapat dihitung dengan rumus berikut:
51 % daya hambat = rata rata OD kontrol sel rata rata OD sampel rata rata OD kontrol sel x 100 % Setelah diperoleh persen daya hambat, kemudian dibuat grafik antara % daya hambat vs konsentrasi sampel, dan diperoleh garis lurus dengan persamaan: y = mx + b. Nilai IC 50 diperoleh dari nilai x, dengan mensubstitusikan y = 50, yaitu nilai yang menyebabkan penurunan absorbansi sebanyak 50 %. x = Keterangan: 50 b m y x b m : persen daya hambat : konsentrasi bahan uji : konstanta : slope/kemiringan Klasifikasi aktivitas sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker dapat digolongkan kategori sangat aktif jika nilai IC 50 < 10 μg/ml, kategori aktif jika nilai IC 50 10 100 μg/ml dan kategori cukup aktif jika nilai IC 50 100-500 μg/ml (Weerapreeyakul et al., 2012). Menurut Cao (1998), senyawa murni digolongkan sangat aktif apabila memiliki nilai IC 50 < 5 μg/ml, aktif 5-10 μg/ml, sedang 11-30 μg/ml dan tidak aktif >30 μg/ml. 4.4.5 Identifikasi senyawa toksik 4.4.5.1 Uji fitokimia Harborne (1987) melaporkan uji golongan senyawa kimia dapat dilakukan dengan menggunakan pereaksi pendeteksi golongan senyawa, meliputi:
52 a. Pereaksi pendeteksi golongan senyawa flavonoid 1) Test dengan NaOH 10% 0,02 g sampel + beberapa tetes pereaksi NaOH 10%, reaksi positif apabila terjadi perubahan warna menjadi coklat. 2) Test Wilstatter 0,02 g sampel + beberapa tetes HCl pekat + 2-3 potongan kecil logam Mg, reaksi positif apabila memberikan warna merah-orange. 3) Test Bate-Smith dan Metacalf 0,02 g sampel + beberapa tetes HCl pekat kemudian dipanaskan, reaksi positif apabila memberikan warna merah yang konsisten. b. Pereaksi pendeteksi golongan senyawa alkaloid 1) Test Dragendorff 0,02 g sampel + HCl 0,1 N + beberapa tetes pereaksi Dragendorff, reaksi positif apabila terdapat endapan warna merah. 2) Test Mayer 0,02 g sampel + HCl 0,1 N + beberapa tetes pereaksi Mayer, reaksi positif apabila terbentuk endapan warna putih. 3) Test Wagner 0,02 g sampel + HCl 0,1 N + beberapa tetes pereaksi Wagner, reaksi positif apabila terbentuk endapan warna coklat.
53 c. Pereaksi pendeteksi golongan senyawa triterpenoid dan steroid 1) Pereaksi Liebermann-Burchard 0,02 g sampel + pereaksi Liebermann-Burchard, reaksi positif apabila terjadi perubahan warna menjadi ungu-merah-coklat untuk triterpenoid dan warna biru-hijau untuk steroid. 2) Pereaksi H 2 SO 4 10 % 0,02 g sampel + pereaksi H 2 SO 4 10 %, reaksi positif apabila terjadi perubahan warna menjadi ungu-merah-coklat untuk triterpenoid dan warna biru-hijau untuk steroid. d. Uji saponin dengan busa/buih (the froth test) 0,02 g sampel + 10 ml H 2 O panas, reaksi positif bila terbentuk busa stabil kira-kira 10 detik setelah dikocok kuat-kuat dan tidak hilang bila ditambahkan asam klorida encer. e. Pereaksi pendeteksi senyawa asam fenolat 0,02 g sampel + beberapa tetes pereaksi besi (III) klorida 1 %, reaksi positif apabila terjadi perubahan warna menjadi ungu, biru atau hitam yang kuat. 4.4.5.2 Pengukuran Spektrum Kromatografi Gas-Spektroskopi Massa Isolat toksik yang sudah diuji antikanker terhadap sel Hela diidentifikasi senyawanya menggunakan GC-MS dengan parameter kerja yang telah baku pada alat tersebut. Spektrum massa dari isolat aktif yang diperoleh selanjutnya dibandingkan dengan spektrum pembanding yang telah terprogram pada alat GC- MS (standard reference) sehingga senyawa hasil isolasi dapat diperkirakan strukturnya.
54 Spons Genus Haliclona Grant, 1836 (SAMPEL) SERBUK SAMPEL - dibersihkan, dipotong kecil-kecil - dimaserasi dengan etanol dan metanol - dipekatkan dengan penguap putar vakum - EKSTRAK PEKAT EKSTRAK TOKSIK - Uji antikanker - diuji toksisitas terhadap Artemia salina Leach terhadap sel Hela - dilarutkan dalam 250 ml air - dipartisi dengan n-heksana - dipisahkan - LAPISAN n-heksana LAPISAN AIR - dievavorasi - dipartisi dengan kloroform - dipisahkan - dievavorasi EKSTRAK KENTAL n-heksana (EH) LAPISAN KLOROFORM EKSTRAK KENTAL KLOROFORM (EK) LAPISAN AIR - dievavorasi - dievavorasi EKSTRAK KENTAL AIR (EA) EKSTRAK PALING TOKSIK - diuji toksisitas terhadap Artemia salina Leach - di KLT - di kromatografi kolom - Eluat ditampung setiap 3 ml Botol 1 Botol 2 Botol 3 Botol 4 Botol 5 Botol n KLT penggabungan Fraksi 1 Fraksi 2 Fraksi 3 Fraksi 4 Fraksi n - - dievaporasi - - diuji diuji toksisitas terhadap Artemia Artemia salina salina Leach Leach - - FRAKSI PALING TOKSIK - Uji kemurnian ISOLAT TOKSIK RELATIF MURNI ISOLAT AKTIF TERIDENTIFIKASI - Uji fitokimia - Identifikasi dengan KG-SM - Uji antikanker terhadap sel HeLa SENYAWA AKTIF ANTIKANKER Gambar 4.1 Skema Kerja