15 METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan selama bulan Agustus-September tahun 2009 di Laboratorium Fisiologi-Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Materi Penelitian Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain; Rana sp, larutan Ringer Laktat dan produk bio ATP cair. Sedang peralatan yang digunakan antara lain papan katak, jarum pentul, scalpel, gunting, benang, gelas arloji, dan mekanomiogram yang terdiri atas kimograf, statif dan klem, pencatat otot, klem femur, sinyal magnit perangsang, stimulator induksi beserta elektroda perangsang. Alat a. Kimograf Kimograf merupakan sebuah alat pencatat gerakan, misalnya kerutan otot, denyut jantung, dan sebagainya. Gambar kimograf milik lab faal IPB yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada gambar 5 berikut; Gambar 7 Kimograf dan stimulator induksi (dokumentasi pribadi)
16 b. Stimulator Induksi Stimulator induksi berbentuk sebuah kotak balok yang pada permukaan depannya terdapat : a. Empat pasang lubang kontak untuk elektroda perangsang dan sinyal magnet b. Tombol pemutar tromol dengan lima kecepatan berbeda c. Tombol elektroda perangsang d. Tombol yang dapat digerakkan, tergantung kepada rangsang/stimulasi yang hendak diberikan (tunggal, multiple, atau tetanik) e. Tombol pengatur voltase b c e a d Gambar 8 Stimulator induksi (dokumentasi pribadi) Agar mendapat perekaman yang sempurna, ujung pencatat bergerak pada bidang singgung kertas kimograf dan bergerak bebas dengan tekanan sedang. Kecepatan perputaran tromol yang tersedia dan dapat digunakan terbagi dalam lima tingkatan, seperti diperlihatkan dalam tabel berikut;
17 Tabel 1 Kecepatan perputaran tromol Kecepatan mm/s Waktu 1 0,05 125 sec 2 0,25 25 sec 3 2,5 2,5 sec 4 25 0,25 sec 5 625 0,01 sec c. Elektroda Perangsang Elektroda perangsang terdiri atas sebuah gagang dengan dua buah ujung logam logam yang berfungsi sebagai elektroda yang dialiri arus listrik. Metode Penelitian Penelitian ini merupakan studi in vitro yang dilakukan terhadap katak jenis Rana sp dengan berat antara 50-70 gram. Otot yang digunakan dalam penelitian ini adalah otot gastrocnemius sebanyak lima buah, dan pada setiap otot dilakukan tiga kali perekaman. Larutan ringer laktat yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari laboratorium utama Fisiologi departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi Fakultas Kedokteran Hewan Iinstitut Pertanian Bogor dan ATP sebagai bahan uji berasal dari produk ATP yang didapat dari apotik hewan setempat. Setelah perekaman selesai dan sebelum kertas dilepas dari tromol, kertas diberi tanda atau identitas. Data diambil dari rasio antara tinggi gelombang (amplitudo) awal setelah kontraksi tetani dengan amplitudo dari gelombang kontraksi tunggal sebelum stimulasi tetani diberikan. a. Kerangka Konsep Aktivitas Otot Intensitas Tinggi Kebutuhan Energi Aerob tidak Mencukupi ATP Hidrolisis dan Glikolisis Anaerob Meningkat Pemulihan Kelelahan Otot Pemberian ATP dari Luar Kelelahan Otot
18 b. Alur Penelitian Otot Gastrocnemius + Ringer Laktat dirangsang dengan intensitas rangsangan yang berkala untuk mendapatkan rangsangan submaksimal rangsangan submaksimal tetani rangsangan submaksimal tetani rangsangan submaksimal tetani Otot Gastrocnemius + Ringer Laktat Otot Gastrocnemius + Ringer Laktat + 1 ml ATP Otot Gastrocnemius + Ringer Laktat + 2 ml ATP dilakukan perekaman dilakukan perekaman dilakukan perekaman c. Parameter yang Diteliti Parameter yang diteliti adalah tingkat timbulnya pemulihan kelelahan otot ditandai dengan peningkatan kekuatan kontraksi otot atau memendeknya amplitudo gelombang kontraksi saat otot ditetanasi (dirangsang dengan frekuensi tinggi), yang terlihat pada rekaman mekanomiogram otot gastrocnemius yang diberi perlakuan. d. Teknik Pengambilan Otot Gastrocnemius Katak yang telah dimatikan diletakkan di atas papan katak dengan posisi tertelungkup dan difiksir dengan menggunakan jarum pentul. Kemudian fascia antara m. biceps femoralis dengan m. semimembranosus disayat menggunakan scalpel. Kedua otot tersebut dikuakkan sampai n. ischiadicus dan a. femoralis kelihatan dengan jelas. Lalu dilakukan penelusuran n. ischiadicus ke bagian atas sambil menggunting otot-otot di sebelah atasnya, sampai ke daerah pungggung
19 kemudian dipotong tulang di lateral perut dengan gunting. Kulit dan otot perut dibuka dan disingkirkan jeroannya. Sambil tetap mengikuti dan mengamati n. ischiadicus, pinggul dipotong supaya lebih mudah mengisolasi n. ischiadicus sampai di bagian paha. Lalu n. ischiadicus diikat dengan benang pada bagian ujung di tempat keluarnya dari sumsum punggung. Untuk isolasi selanjutnya yang dipegang adalah benang dan bukan sarafnya. Kemudian n. ischiadicus dipotong di bagian atas ikatan benang dan dibersihkan saraf tersebut dari otot. Kulit kaki dan paha dikupas dengan cara menarik dari atas ke bawah. Lalu tendo Achiles dipotong untuk mengisolasi m. gastrocnemius dan dipotong juga sekitar ¼ bagian os femur dan biceps. Setelah didapatkan sediaan otot-saraf yang terdiri atas ¼ bagian os femur, n. ischiadicus, m. gastrocnemius, dan ¼ bagian biceps, sediaan tersebut dimasukkan ke dalam gelas arloji yang berisi larutan Ringer (Staf Fisiologi 2001). e. Pemberian Perlakuan dan Perekaman Mekanomiogram Otot difiksasi dengan klem (penjepit otot) atau jarum pentul besar jika menggunakan bak khusus. Lalu tendo Achiles diikatkan dengan benang pada alat pencatat kontraksi, jangan sampai kendur. Selama percobaan diusahakan agar preparat otot tetap dibasahi dengan Ringer Laktat. Kemudian dihubungkan kabel listrik (dari baterai ke induktorium) dengan alat pencatat rangsangan. Disentuhkan elektroda perangsang pada saraf atau ototnya dan alat pencatat ke drum kimograf (pencatat kontraksi). Ditentukan frekuensi rangsangan yang diinginkan. Beberapa diantaranya yaitu frekuensi tunggal, faradic, ataupun tetanik. Ditentukan juga voltase bawah ambang, submaksimal, dan maksimal dengan cara memulai rangsangan dengan voltase yang terkecil dan menaikkan kekuatan rangsang 0,5 volt, hingga didapatkan rangsang submaksimal. Satu kali perekaman terdiri dari perekaman dengan rangsangan frekuensi rendah dan tinggi. Setelah selesai perekaman pertama dengan ringer laktat kemudian sediaan uji ditetesi dengan ATP cair 1 ml berturut-turut untuk perekaman kedua dan ketiga, tetap dengan rangsang submaksimal yang sama. Setelah perekaman selesai dan sebelum kertas dilepas dari tromol, kertas diberi tanda atau identitas. Data diambil dari rasio antara tinggi
20 gelombang (amplitudo) awal setelah kontraksi tetani dengan amplitudo dari gelombang kontraksi tunggal sebelum stimulasi tetani diberikan. B A Gambar 9 Hasil perekaman mekanomiogram. keterangan : A menunjukkan tinggi amplitudo awal pada kondisi tetani. B menunjukkan tinggi amplitudo pada kondisi normal (stimulasi tunggal). Analisis Data Data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan program Statistical for Social Sciences 11.5. Sebelumnya dilakukan uji normalitas terlebih dahulu untuk memastikan data berdistribusi normal atau tidak. Pada semua data dilakukan perhitungan rerata (mean) dan simpangan baku (standard deviation), bila data mempunyai distribusi normal selanjutnya dilakukan uji parametrik ANOVA (analysis of variance), sedangkan bila data tidak normal distribusinya maka dilakukan uji nonparametrik (Sastroasmoro dan Sofyan 2002).