Halaman 1 dari 7 FARMASI UGM Dokumen nomor : 0201400 Tanggal : 24 Maret 2009 URAIAN DIBUAT OLEH DIPERIKSA OLEH DIPERIKSA OLEH DISETUJUI OLEH Jabatan Staf Staf Supervisor Pimpinan Paraf Nama Aditya Fitriasari Sendy Junedi Muthi Ikawati Edy Meiyanto Tanggal 24 Maret 2009 PROSEDUR TETAP PREPARASI SAMPEL UNTUK FLOWCYTOMETRY DAFTAR ISI HALAMAN DAFTAR ISI 1 A. RIWAYAT REVISI DOKUMEN 2 B. TUJUAN 2 C. PENDAHULUAN 2 D. OPERASIONAL 3 1. Alat 3 2. Bahan 3 3. Prosedur Kerja 3 4. Analisis dan Interpretasi Data 6
Halaman 2 dari 7 Dokumen nomor : 0201400 Tanggal : 24 Maret 2009 A. RIWAYAT REVISI DOKUMEN No Dokumen Tanggal Dibuat oleh Diperiksa oleh Diperiksa oleh Disetujui oleh Endah P Riris Istighfari J Edy Meiyanto Septi Staff Supervisor Pimpinan Isi Menggunakan format lama Belum ada penomoran dokumen Belum ada prosedur pencatatan pada buku komunikasi harian No Dokumen Tanggal Dibuat oleh Diperiksa oleh Diperiksa oleh Disetujui oleh 02 Aditya Sendy Junedi Muthi Ikawati Edy Meiyanto 01400 Fitriasari Staff Staff Supervisor Pimpinan Isi Menggunakan format baru Sudah ada penomoran dokumen Menyebutkan prosedur pencatatan pada buku komunikasi harian B. TUJUAN Memberikan panduan secara detail dan bertahap mulai dari persiapan, pembuatan sampel dan reagen, perlakuan, preparasi sampel untuk flowcytometry, analisis dan interpretasi data hasil flowcytometry. C. PENDAHULUAN Flowcytometry merupakan suatu teknik yang digunakan untuk menganalisis jenisjenis sel yang terdapat pada suatu populasi sel. Sel dilabel fluoresen, dilewatkan celah sempit, dan ditembak sinar. Pada suatu populasi sel yang sejenis, misal pada sel kanker yang diberi perlakuan suatu senyawa sitotoksik, dapat dilakukan analisis terhadap fasefase daur sel, sel apoptosis, serta sel yang mengalami poliploidi. Masingmasing jenis sel tersebut memiliki perbedaan pada jumlah set kromosom di mana pada fase G0/G1, fase S, fase G2/M berturutturut memiliki 2, 3, dan 4 set kromosom. Semakin banyak jumlah set kromosom, maka intensitas sinyal optik yang diberikan semakin kuat karena kemampuan fluoresen untuk berinterkalasi pada DNA semakin besar. Pada sel yang mengalami apoptosis (sub G0), intensitas fluoresen sangat lemah karena kromosom telah mengalami fragmentasi. Sedangkan pada sel poliploidi, intensitas yang diberikan sangat kuat karena jumlah set kromosom yang lebih dari 4 set.
Halaman 3 dari 7 Dokumen nomor : 0201400 Tanggal : 24 Maret 2009 D. OPERASIONAL 1. Alat a. 6 well plate b. Mikropipet 10, 20, 200, 1000 µl c. Tabung sentrifus 1,5 ml d. Rak tabung kecil e. Sentrifugator f. Inkubator CO 2 g. Penangas air (37 C) h. FACSCalibur 2. Bahan a. Sampel dengan konsentrasi tertentu b. Phosphat Buffer Saline (PBS) 1x ph 7 c. Media kultur (MK) d. TripsinEDTA 0,25% e. RNase f. Propidium iodide g. TritonX h. Buangan untuk media bekas dan PBS 3. Prosedur a. Perlakuan (treatment) No Pekerjaan Perhatian 1. Ikuti protokol Persiapan Kerja In Vitro di Laboratorium. 2. Ambil sel dari inkubator CO 2, amati kondisi sel. Gunakan kultur sel dalam kondisi 7080% konfluen untuk dipanen. 3. Panen sel sesuai dengan protokol panen. 4. Hitung jumlah sel dan buat pengenceran sel dengan MK sesuai kebutuhan mengikuti protokol penghitungan sel. Jumlah sel yang dibutuhkan untuk 6 well plate adalah 5x10 5 sel/sumuran (5x10 5 sel/1000 µl). 5. Transfer sel ke dalam sumuran 6 well plate, masingmasing 1000 µl (untuk perlakuan dan untuk kontrol sel). 6. Amati keadaan sel di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Dokumentasikan dengan kamera. 7. Inkubasi sel di dalam inkubator selama semalam (agar sel pulih kembali setelah panen). 8. Setelah sel normal kembali, segera buat seri konsentrasi sampel dan agen kemoterapi (misal: Doxorubicin) untuk perlakuan. Seri konsentrasi terdiri dari 2 konsentrasi: ¼ IC 50 dan 1/10 IC 50. Jika dalam waktu semalam kondisi sel belum pulih, ganti media dan sel diinkubasikan kembali. Selalu amati kondisi sel sebelum perlakuan. Untuk masingmasing konsentrasi sampel dan agen kemoterapi buat volume 500 µl (bisa dilebihkan sedikit). Konsentrasi sampel dan Doxorubicin dibuat dua kali konsentrasi untuk perlakuan, karena
Halaman 4 dari 7 Dokumen nomor : 0201400 Tanggal : 24 Maret 2009 9. Ambil plate yang telah berisi sel dari inkubator. di dalam sumuran akan mengalami pengenceran oleh sampel/doxorubicin atau MK. 10. Buang media sel dengan menggunakan pipet Pasteur secara perlahanlahan. 11. Cuci dengan 500 µl PBS ke dalam semua sumuran yang terisi sel. 12. Buang PBS dengan pipet Pasteur secara perlahanlahan. 13. Untuk kelompok perlakuan kombinasi : Masukkan 500 µl seri konsentrasi sampel ke dalam sumuran. Kemudian tambahkan 500 µl seri konsentrasi Doxorubicin untuk kombinasi. 14. Untuk perlakuan tunggal : Masukkan 500 µl seri konsentrasi sampel atau Doxorubicin ke dalam sumuran. Kemudian tambahkan 500 µl MK. 15. Untuk kontrol sel : Tambahkan 1000 µl MK ke dalam sumuran. 16. Inkubasi di dalam inkubator CO 2 selama 24 jam. 17. Menjelang akhir waktu inkubasi, dokumentasikan kondisi sel untuk setiap perlakuan dengan kamera. b. Pembuatan reagen flowcytometry 1) Stok awal reagen : a) Propidium Iodide (PI) : 1 mg/ml / 50x Timbang 1 mg PI, larutkan dalam 1000 µl PBS. Fungsi : Mewarnai DNA sel (fluorochrome). Penyimpanan : Dibungkus aluminium foil dan di freezer. b) RNase : 10 mg/ml Fungsi : Mendegradasi RNA. Penyimpanan : Di freezer. c) TritonX 100 (pro GC Merck) : 1x Fungsi : Melisis membran sel. Penyimpanan : Di temperatur kamar.
Halaman 5 dari 7 Dokumen nomor : 0201400 Tanggal : 24 Maret 2009 2) Reagen flowcytometry untuk 1 sampel : 25 µl PI (50x) + 2,5 µl RNase + 0,5 µl TritonX + PBS ad 500 µl Untuk 6 sumuran, buat untuk 6 sampel (dibuat berlebih untuk 7 sampel). Bungkus aluminium foil. Perhatian : Senyawa karsinogen (interkalasi DNA), pakai sarung tangan! 3) Konsentrasi akhir reagen dalam PBS 500 µl : a) Propidium Iodide (PI) : 50 g/ml b) RNase : 50 µg/ml c) TritonX 100 (pro GC Merck) : 0.1 % c. Preparasi sampel untuk flowcytometry No Pekerjaan Perhatian 1. Siapkan 2 eppendorf untuk 1 jenis perlakuan. Eppendorf I dan eppendorf II. 2. Ambil media dari sumuran dengan mikropipet 1 ml, transfer ke eppendorf I, jika kurang masukkan ke eppendorf II. 3. Sentrifus dengan kecepatan 2000 rpm selama 3 menit (Gambar A). 4. Buang media dengan cara dituang. 5. Isikan @ 500µl PBS ke dalam sumuran. 6. Ambil PBS dengan mikropipet dan transfer ke dalam eppendorf I. 7. Sentrifus dengan kecepatan 2000 rpm selama 3 menit. 8. Buang PBS dengan cara dituang. 9. Ulangi pencucian dengan PBS (tahap 58) sekali lagi. 10. Tambahkan 150 µl tripsinedta 0,25%, inkubasi di inkubator selama 3 menit. 11. Tambahkan @ 1 ml MK, resuspensi sampai sel lepas satu per satu, amati di bawah mikroskop. 12. Setelah sel terlepas satusatu, transfer sel ke eppendorf I dan/ II. 13. Tambahkan kembali 500 µl PBS ke dalam sumuran untuk mengambil sisa sel, kemudian transfer ke dalam eppendorf II. 14. Sentrifus semua eppendorf dengan kecepatan 2000 rpm selama 3 menit. 15. Buang MK/PBS dengan cara dituang, tambahkan dan resuspen pellet sel dengan @ 500 µl PBS dingin. 16. Gabungkan suspensi sel dalam kedua eppendorf ke dalam eppendorf I. Bilas eppendorf kosong dengan PBS, transfer ke eppendorf I. Hatihati, jangan lebih dari 3 menit. MK untuk menginaktivasi tripsin.
Halaman 6 dari 7 Dokumen nomor : 0201400 Tanggal : 24 Maret 2009 17. Sentrifus eppendorf I dengan kecepatan 2000 rpm selama 3 menit. 18. Buang PBS dengan cara dituang. 19. Tambahkan reagen flowcytometry @ 400 µl, resuspen dengan homogen. 20. Bungkus tiap eppendorf dengan alufoil. Beri penandaan pada bagian atas eppendorf. 21. Inkubasi di waterbath 37 C, 10 menit. Untuk mengaktivasi RNase. 22. Jangan disimpan di kulkas/freezer/suhu kamar. Penyimpanan pada kulkas, freezer, dan pada suhu kamar akan meningkatkan debris. 23. Resuspen lagi sebelum ditransfer ke flowcytotube. 24. Transfer suspensi sel ke dalam flowcytotube melalui filter (kain nylon/kain kaca) menggunakan mikropipet 1 ml. 25. Baca dengan flowcytometer FACS Calibur untuk mengetahui profil cell cycle (Gambar B). Tutup flowcytotube dilubangi terlebih dahulu. Deteksi dilakukan terhadap 10.000 atau 20.000 sel. 26. Setiap selesai melakukan pekerjaan, lakukan sanitasi seperti pada Protokol Persiapan Kerja In Vitro di Laboratorium. A B Gambar. (A) Sentrifugator Sorvall; (B) Flowcytometer FACSCalibur. 4. Analisis dan Interpretasi Data Data flowcytometry dianalisis dengan program cell quest untuk melihat distribusi sel pada fasefase daur sel sub G1 (apoptosis), S, G2/M, dan sel yang mengalami poliploidi. Penghambatan daur sel yang terjadi dapat diketahui dengan membandingkan antara efek perlakuan larutan uji dengan kontrol.
Halaman 7 dari 7 Dokumen nomor : 0201400 Tanggal : 24 Maret 2009 Contoh Hasil Flowcytometry : 44,81% 6,50 % Sub G1 G1 27,64 % G2/M 13,35 % S 8,17 % Polyploid 6,67% Sub G1 37,95% G1 9,86% 35,76% G2/M 10,21 S Polyploid Analisis daur sel MCF7 dengan flowcytometry Perlakuan Doxorubicin 350 nm dengan inkubasi 24 jam menunjukkan penghambatan pada fase G1 dan G2/M. Jika ada sesuatu dalam SOP ini tidak bisa dilakukan atau tidak sesuai dengan kenyataan dilapangan, segera laporkan kepada Staff/Supervisor r