Lampiran 1. Spesifikasi Bahan Nama, Spesifikasi dan Kegunaan Bahan Penelitian No. Nama Bahan Spesifikasi Kegunaan 1. Larva ikan nilem hasil kejut panas Berumur 30, 60, 90, dan 120 hari Hewan uji 2. Pakan ikan 41% protein dan 6% lemak Pakan hewan uji komersial 3. Ovaprim - Hormon analog 4. Bouin Asam Pikrat Jenuh Larutan fiksatif Aguosa, formalin, Asam Asetat Glasial 5. Alkohol 70% - Agent dehidrasi 6. Alkohol 80% - Agent dehidrasi 7. Alkohol 90% - Agent dehidrasi 8. Alkohol 100% - Agent dehidrasi 9. Xylol - Agent clearing 10. Akuades - Pelarut 11. Parafin SIGMA Media penanaman (embedding) 12. Carrazi s Hematoxylin 0,5 g, Zat Pewarna Haematoxylin Potasium iodate 0,01g, Potasium alum 25g, Glycerol 100ml, dan akuades 400ml 13. Eosin 1% Eosin Y 1g dan akuades 100ml Zat Pewarna 14. Enthelan - Mounting 15. Gelatin 1% Gelatin 10gr, Akuades 1000ml 16. Giemza - Zat Pewarna 17. Metanol - Larutan fiksatif Perekat pada object glass 30
Lampiran 2. Spesifikasi Peralatan Nama, tipe, kegunaan dan keberadaan alat No. Nama Alat Merek/Tipe Kegunaan Tempat 1. Inkubator JEIO TECH IB-600M Menginkubasi jaringan 2. Mikrotom MICROM GmbH Type Memotong jaringan organ Laboratorium Pengajaran I HM 340 yang telah diembeding 3. Gelas ukur 2000ml - Mengukur volume air 4. Aerator Recent Suplai oksigen 5. Timbangan analitik CHQ Menimbang kemikalia dan ikan 6. Mikroskop Olympus Mengamati preparat histologi 7. Baskom plastic - Tempat pemeliharaan larva ikan nilem 8. Botol sampel - Tempat sampel ikan 9. Lampu spiritus - Melelehkan parafin saat penanaman organ 10. Pinset - Mengambil dan memindahkan organ 11. Skapel - Memotong organ 12. Object glass - Menaruh hasil irisan dan apusan darah 13. Cover glass - Menutup hasil irisan dan apusan darah pada object glass 14. Milimeter block - Mengukur ikan 31
Lanjutan Lampiran 2. No. Nama Alat Merek/Tipe Kegunaan Tempat 15. Hot plate - Memanaskan cairan 16. Eye piece graticle - Menghitung luas sel 17. Gunting bedah - Memotong dan membedah sampel 18. Spuit 1 ml - Menyuntik ikan 32
Lampiran 3. Prosedur Pembuatan Sediaan Histologi 1. Ikan yang telah diukur panjang dan beratnya dimatikan. 2. Proses embedding menggunakan metode paraffin dilakukan dengan tahapan sebagai berikut : i. Tahapan pertama yaitu ikan difiksasi dengan menggunakan larutan bouin selama 2 x 24 jam. ii. Spesimen didehidrasi dengan menggunakan larutan alkohol bertingkat mulai dari 70%, 80%, 90% dan 100% dua kali masing-masing selama 40 menit. iii. Spesimen didealkoholisasi menggunakan alkohol : xylol (3:1), alkohol: xylol (1:1), alcohol : xylol (1:3), dan xylol murni dua kali masing-masing selama 30 menit. iv. Spesimen diinfiltrasi menggunakan xylol : paraffin (3:1), xylol : paraffin (1:1), xylol : paraffin (1:3) masing-masing 35 menit dan paraffin murni dua kali masing selama 40 menit. v. Spesimen ditanam di dalam paraffin dengan cara paraffin cair dituangkan ke dalam cetakan yang terbuat dari kertas karton yang berukuran 2 x 2 cm. Spesimen kemudian diletakkan sesuai dengan orientasi pengirisan yang diinginkan dan dibiarkan hingga paraffin memadat selama 24 jam. 3. Setelah paraffin membeku direkatkan pada holder dari kayu dan diberi kode nomor spesimen. 4. Pengirisan blok paraffin dilakukan dengan menggunakan rotary microtome dengan ketebalan 5 µm. 5. Pita yang didapatkan dari hasil pemotongan dicelupkan kedalam air hangat dan kemudian dilekatkan ke objek glas yang telah dilapisi gelatin 1 %. 6. Proses Pewarnaan jaringan dilakukan dengan tahapan sebagai berikut : i. Deparafinisasi jaringan dengan cara mencelupkannya kedalam xylol murni dua kali masing-masing selama 5 menit. ii. Rehidrasi jaringan dengan cara mencelupkannya kedalam larutan alkohol 100% dua kali, 90%, 80%, 70%, dan akuades masing-masing 30 celupan sampai warnanya terlihat jernih. iii. Jaringan diwarnai dengan Carrazi s Haematoxylin selama 10 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1 menit. 33
iv. Jaringan diwarnai dengan eosin selama 2 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1 menit dan dicelupkan kedalam akuades sebanyak 30 celupan. v. Jaringan didehidrasi dalam larutan alkohol bertingkat mulai dari 70%, 80%, 90%, dan 100% dua kali masing-masing sebanyak 30 celupan. vi. Jaringan diclearing dalam xylol murni 2x masing-masing 5 menit. Jaringan ditetesi dengan entelan new sebanyak 1-2 tetes lalu tutup dengan cover glass. vii. Spesimen diberi label sesuai dengan nomor sampel. 34
Lampiran 4. Prosedur Pembuatan Apus Darah 1. Siapkan 2 gelas benda, kemudian dibersihkan dengan alkohol 70% dan dikeringanginkan. 2. Pengambilan sampel darah ikan diambil dengan cara memotong ekor ikan, kemudian tetesan darah yang didapat diteteskan di atas salah satu ujung gelas benda. 3. Letakkan gelas benda yang lain pada tepi/sisi yang pendek di muka tetesan darah hingga membentuk sudut sekitar 45, kemudian tariklah sedikit kebelakang hingga gelas benda kedua mencapai bagian tengah dari tetesan darah agar timbul gerakan kapiler agar darah menyebar merata ke kiri dan kanan gelas benda pertama. 4. Doronglah gelas benda kedua kearah depan hingga diperoleh apusan yang rata, kemudian apusan darah dikering anginkan. 5. Apusan darah difiksasi dengan larutan metanol selama 5 menit, dikering anginkan. 6. Diwarnai dengan larutan Giemsa selama 10 menit, setelah tampak mengering. Bilas pewarma dengan air mengalir dengan debit air kecil. 7. Apusan yang telah terwarna dikering anginkan kemudian diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran rendah kemudian dengan perbesaran tinggi. 35
Lampiran 5. Hasil analisis ANOVA panjang eritrosit ikan nilem (Osteochilus hasselti C.V.) hasil kejut panas pada menit ke 25, 27, dan 29 setelah pencampuran milt dan oosit. Dependent Variable:Panjang Sel Tests of Between-Subjects Effects Source Type III Sum of Squares df Mean Square F Sig. Corrected Model 26.467 a 3 8.822 16.777.000 Intercept 10791.274 1 10791.274 2.052E4.000 Kejut 26.467 3 8.822 16.777.000 Error 35.758 68.526 Total 10853.499 72 Corrected Total 62.225 71 Descriptive Statistics Dependent Variable:Panjang Sel Kejut Mean Std. Deviation N Kontrol 11.1956.68119 18 25 Menit 12.6450.58036 18 27 Menit 12.6128.79764 18 29 Menit 12.5167.81630 18 Total 12.2425.93617 72 36
Multiple Comparisons Panjang Sel Tukey HSD (I) Kejut (J) Kejut Mean 95% Confidence Interval Difference (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound Kontrol 25 Menit -1.4494 *.24172.000-2.0861 -.8128 27 Menit -1.4172 *.24172.000-2.0538 -.7806 29 Menit -1.3211 *.24172.000-1.9577 -.6845 25 Menit Kontrol 1.4494 *.24172.000.8128 2.0861 27 Menit.0322.24172.999 -.6044.6688 29 Menit.1283.24172.951 -.5083.7650 27 Menit Kontrol 1.4172 *.24172.000.7806 2.0538 25 Menit -.0322.24172.999 -.6688.6044 29 Menit.0961.24172.979 -.5405.7327 29 Menit Kontrol 1.3211 *.24172.000.6845 1.9577 25 Menit -.1283.24172.951 -.7650.5083 27 Menit -.0961.24172.979 -.7327.5405 37
Lampiran 6. Hasil analisis ANOVA panjang inti eritrosit ikan nilem (Osteochilus hasselti C.V.) hasil kejut panas pada menit ke 25, 27, dan 29 setelah pencampuran milt dan oosit. Dependent Variable:Panjang Inti Tests of Between-Subjects Effects Source Type III Sum of Squares df Mean Square F Sig. Corrected Model 8.884 a 3 2.961 13.025.000 Intercept 2087.549 1 2087.549 9.182E3.000 Kejut 8.884 3 2.961 13.025.000 Error 15.460 68.227 Total 2111.894 72 Corrected Total 24.345 71 Descriptive Statistics Dependent Variable:Panjang Inti Kejut Mean Std. Deviation N Kontrol 4.9767.41746 18 25 Menit 5.9461.50948 18 27 Menit 5.3133.38117 18 29 Menit 5.3022.57472 18 Total 5.3846.58556 72 38
Multiple Comparisons Panjang Inti Tukey HSD (I) Kejut (J) Kejut Mean 95% Confidence Interval Difference (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound Kontrol 25 Menit -.9694 *.15894.000-1.3880 -.5508 27 Menit -.3367.15894.158 -.7553.0819 29 Menit -.3256.15894.181 -.7442.0930 25 Menit Kontrol.9694 *.15894.000.5508 1.3880 27 Menit.6328 *.15894.001.2142 1.0514 29 Menit.6439 *.15894.001.2253 1.0625 27 Menit Kontrol.3367.15894.158 -.0819.7553 25 Menit -.6328 *.15894.001-1.0514 -.2142 29 Menit.0111.15894 1.000 -.4075.4297 29 Menit Kontrol.3256.15894.181 -.0930.7442 25 Menit -.6439 *.15894.001-1.0625 -.2253 27 Menit -.0111.15894 1.000 -.4297.4075 39
Lampiran 7. Hasil analisis ANOVA volume inti eritrosit ikan nilem (Osteochilus hasselti C.V.) hasil kejut panas pada menit ke 25, 27, dan 29 setelah pencampuran milt dan oosit. Dependent Variable:Volume Ikan Tests of Between-Subjects Effects Source Type III Sum of Squares df Mean Square F Sig. Corrected Model 148.113 a 3 49.371 12.209.000 Intercept 25517.664 1 25517.664 6.310E3.000 Kejut 148.113 3 49.371 12.209.000 Error 274.986 68 4.044 Total 25940.763 72 Corrected Total 423.099 71 Descriptive Statistics Dependent Variable:Volume Ikan Kejut Mean Std. Deviation N Kontrol 16.8956 1.76029 18 25 Menit 20.9433 1.99248 18 27 Menit 18.7078 2.03376 18 29 Menit 18.7567 2.22953 18 Total 18.8258 2.44113 72 40
Multiple Comparisons Volume Ikan Tukey HSD (I) Kejut (J) Kejut Mean 95% Confidence Interval Difference (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound Kontrol 25 Menit -4.0478 *.67032.000-5.8132-2.2824 27 Menit -1.8122 *.67032.042-3.5776 -.0468 29 Menit -1.8611 *.67032.035-3.6265 -.0957 25 Menit Kontrol 4.0478 *.67032.000 2.2824 5.8132 27 Menit 2.2356 *.67032.007.4701 4.0010 29 Menit 2.1867 *.67032.009.4212 3.9521 27 Menit Kontrol 1.8122 *.67032.042.0468 3.5776 25 Menit -2.2356 *.67032.007-4.0010 -.4701 29 Menit -.0489.67032 1.000-1.8143 1.7165 29 Menit Kontrol 1.8611 *.67032.035.0957 3.6265 25 Menit -2.1867 *.67032.009-3.9521 -.4212 27 Menit.0489.67032 1.000-1.7165 1.8143 41
Lampiran 8. Hasil analisis ANOVA volume eritrosit ikan nilem (Osteochilus hasselti C.V.) hasil kejut panas pada menit ke 25, 27, dan 29 setelah pencampuran milt dan oosit. Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:Volume Sel Source Type III Sum of Squares df Mean Square F Sig. Corrected Model 100373.404 a 3 33457.801 10.448.000 Intercept 7982969.074 1 7982969.074 2.493E3.000 Kejut 100373.404 3 33457.801 10.448.000 Error 217758.584 68 3202.332 Total 8301101.062 72 Corrected Total 318131.988 71 Descriptive Statistics Dependent Variable:Volume Sel Kejut Mean Std. Deviation N Kontrol 2.8934E2 57.27948 18 25 Menit 3.6402E2 44.71617 18 27 Menit 3.0302E2 75.26873 18 29 Menit 3.7553E2 43.16795 18 Total 3.3298E2 66.93827 72 42
Multiple Comparisons Volume Sel Tukey HSD (I) Kejut (J) Kejut Mean 95% Confidence Interval Difference (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound Kontrol 25 Menit -74.6811 * 18.86305.001-124.3611-25.0012 27 Menit -13.6878 18.86305.887-63.3677 35.9922 29 Menit -86.1978 * 18.86305.000-135.8777-36.5178 25 Menit Kontrol 74.6811 * 18.86305.001 25.0012 124.3611 27 Menit 60.9933 * 18.86305.010 11.3134 110.6733 29 Menit -11.5167 18.86305.928-61.1966 38.1633 27 Menit Kontrol 13.6878 18.86305.887-35.9922 63.3677 25 Menit -60.9933 * 18.86305.010-110.6733-11.3134 29 Menit -72.5100 * 18.86305.002-122.1899-22.8301 29 Menit Kontrol 86.1978 * 18.86305.000 36.5178 135.8777 25 Menit 11.5167 18.86305.928-38.1633 61.1966 27 Menit 72.5100 * 18.86305.002 22.8301 122.1899 43
Lampiran 9. Hasil analisis ANOVA berat tubuh ikan nilem (Osteochilus hasselti C.V.) hasil kejut panas pada menit ke 25, 27, dan 29 setelah pencampuran milt dan oosit. Descriptive Statistics Dependent Variable:Berat Tubuh Kejut Mean Std. Deviation N Kontrol.3867.37450 24 25 Menit.4246.29345 24 27 Menit.3267.33003 24 29 Menit.3488.42332 24 Total.3717.35492 96 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:Berat Tubuh Type III Sum Source of Squares df Mean Square F Sig. Corrected Model.134 a 3.045.347.792 Intercept 13.261 1 13.261 103.102.000 Kejut.134 3.045.347.792 Error 11.833 92.129 Total 25.228 96 Corrected Total 11.967 95 44
Multiple Comparisons Berat Tubuh Tukey HSD (I) Kejut (J) Kejut Mean 95% Confidence Interval Difference (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound Kontrol 25 Menit -.0379.10353.983 -.3088.2330 27 Menit.0600.10353.938 -.2109.3309 29 Menit.0379.10353.983 -.2330.3088 25 Menit Kontrol.0379.10353.983 -.2330.3088 27 Menit.0979.10353.780 -.1730.3688 29 Menit.0758.10353.884 -.1951.3467 27 Menit Kontrol -.0600.10353.938 -.3309.2109 25 Menit -.0979.10353.780 -.3688.1730 29 Menit -.0221.10353.997 -.2930.2488 29 Menit Kontrol -.0379.10353.983 -.3088.2330 25 Menit -.0758.10353.884 -.3467.1951 27 Menit.0221.10353.997 -.2488.2930 45
Lampiran 10. Hasil analisis ANOVA panjang tubuh ikan nilem (Osteochilus hasselti C.V.) hasil kejut panas pada menit ke 25, 27, dan 29 setelah pencampuran milt dan oosit. Descriptive Statistics Dependent Variable:Panjang Ikan Kejut Mean Std. Deviation N Kontrol 2.7917 1.29209 24 25 Menit 3.0254 1.20460 24 27 Menit 2.6667 1.09054 24 29 Menit 2.5750 1.08277 24 Total 2.7647 1.16454 96 Dependent Variable:Panjang Ikan Tests of Between-Subjects Effects Source Type III Sum of Squares df Mean Square F Sig. Corrected Model 2.743 a 3.914.667.574 Intercept 733.776 1 733.776 535.385.000 Kejut 2.743 3.914.667.574 Error 126.091 92 1.371 Total 862.610 96 Corrected Total 128.834 95 46
Multiple Comparisons Panjang Ikan Tukey HSD (I) Kejut (J) Kejut Mean 95% Confidence Interval Difference (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound Kontrol 25 Menit -.2337.33795.900-1.1180.6505 27 Menit.1250.33795.983 -.7593 1.0093 29 Menit.2167.33795.918 -.6676 1.1010 25 Menit Kontrol.2337.33795.900 -.6505 1.1180 27 Menit.3588.33795.714 -.5255 1.2430 29 Menit.4504.33795.545 -.4339 1.3347 27 Menit Kontrol -.1250.33795.983-1.0093.7593 25 Menit -.3588.33795.714-1.2430.5255 29 Menit.0917.33795.993 -.7926.9760 29 Menit Kontrol -.2167.33795.918-1.1010.6676 25 Menit -.4504.33795.545-1.3347.4339 27 Menit -.0917.33795.993 -.9760.7926 47
Lampiran 11. Hasil analisis ANOVA korelasi panjang inti eritrosit dan volume inti eritrosit ikan nilem (Osteochilus hasselti C.V.) hasil kejut panas pada menit ke 25, 27, dan 29. Correlations Panjang Inti Volume Inti Panjang Inti Pearson Correlation 1.934 ** Sig. (2-tailed).000 N 72 72 Volume Inti Pearson Correlation.934 ** 1 Sig. (2-tailed).000 N 72 72 **. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed). 48
Lampiran 12. Hasil analisis ANOVA korelasi panjang eritrosit dan volume eritrosit ikan nilem (Osteochilus hasselti C.V.) hasil kejut panas pada menit ke 25, 27, dan 29. Correlations Panjang Sel Volume Sel Panjang Sel Pearson Correlation 1.458 ** Sig. (2-tailed).000 N 72 72 Volume Sel Pearson Correlation.458 ** 1 Sig. (2-tailed).000 N 72 72 **. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed). 49
Lampiran 13. Hasil analisis ANOVA korelasi panjang tubuh ikan dan panjang eritrosit ikan nilem (Osteochilus hasselti C.V.) hasil kejut panas pada menit ke 25, 27, dan 29. Correlations Panjang Tubuh Panjang sel Panjang Tubuh Pearson Correlation 1.124 Sig. (2-tailed).299 N 72 72 Panjang sel Pearson Correlation.124 1 Sig. (2-tailed).299 N 72 72 50