IV METODOLOGI PENELITIAN 4.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan penelitian ini dilaksanakan pada bulan April 2012 di Laboratorium Pendidikan Perikanan, Fakultas Perikanan dan Kelautan, Universitas Airlangga. 4.2 Materi Penelitian Materi penelitian yang digunakan terdiri atas bahan dan alat penelitian. Bahan penelitian yang akan digunakan adalah S. platensis, pupuk Azolla pinnata, pupuk Walne, air laut dan air tawar, aquades, alkohol, khlorin dan Na Thiosulfat, metanol absolut. Peralatan yang akan digunakan dalam penelitian adalah toples kaca, aerator, selang aerator, gelas ukur, erlenmeyer, sentrifuge, pipet tetes, pipet volume, mikroskop, sedgewick rafter ph paper, handtally counter, termometer, autoclave, lux meter, lampu TL 40 Watt, spektrofotometer, aluminium foil dan kertas saring 4.3 Metode Penelitian 4.3.1 Rancangan Penelitian Rancangan penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap RAL), sebab dalam penelitian ini semua dikondisikan sama kecuali perlakuan (Kusriningrum, 2008) yaitu konsentrasi pupuk cair Azolla pinnata. Perlakuan pada penelitian ini terdiri dari 6 perlakuan dengan 4 ulangan. yang digunakan dalam penelitian ini berdasarkan penelitian yang sudah pernah dilakukan oleh Nurani F.R (2011) tentang pengaruh konsentrasi pupuk Azolla
pinnata terhadap pertumbuhan populasi Spirulina platensis dan didapatkan konsentrasi optimal 3,5 ml/l, sehingga diperoleh konsentrasi perlakuan pupuk Azolla pinnata sebagai berikut: Perlakuan A : pemberian pupuk Azolla pinnata dengan konsentrasi 1,5 ml/l Perlakuan B : pemberian pupuk Azolla pinnata dengan konsentrasi 2,5 ml/l Perlakuan C : pemberian pupuk Azolla pinnata dengan konsentrasi 3,5 ml/l Perlakuan D : pemberian pupuk Azolla pinnata dengan konsentrasi 4,5 ml/l Perlakuan E : pemberian pupuk Azolla pinnata dengan konsentrasi 5,5 ml/l Perlakuan K: kontrol dengan pupuk Walne Desain pengacakan penelitian dapat dilihat pada Gambar 7. A1 B4 K1 D1 B1 E4 A3 D4 B3 D2 K3 A4 K2 C3 E2 E3 C4 C2 E1 K4 C1 A2 D3 B2 Gambar 7. Desain Pengacakan Penelitian 4.3.2 Prosedur Kerja A. Persiapan Penelitian Pada dasarnya persiapan untuk kultur berbagai jenis fitoplankton adalah sama, yaitu sterilisasi alat dan bahan yang bertujuan untuk membunuh mikroorganisme yang tidak diinginkan. Pada kegiatan ini terdapat beberapa macam sterilisasi pada alat dan bahan yang digunakan sebagai media kultur skala laboratorium. Kawachi and Noël dalam Sari (2005) mengemukakan, sterilisasi merupakan suatu proses untuk menjaga kondisi aseptik dengan cara menghilangkan atau membunuh mikroorganisme.
Air laut yang akan digunakan untuk kultur disterilisasi menggunakan larutan khlorin. Air laut terlebih dahulu disaring dengan kapas yang diletakkan dalam corong air, kemudian disterilkan dengan khlorin 60 ppm selama 24 jam. Sisa-sisa khlorin dihilangkan dengan memberikan Na Thiosulfat 20 ppm dan diaerasi sampai khlorin hilang yang ditandai dengan bau khlorin sudah tidak ada. Air laut yang sudah steril disimpan dalam wadah yang tidak tembus cahaya dan tertutup rapat (Ekawati, 2005). Perangkat yang terbuat dari kaca yang tahan panas disterilkan menggunakan autoklaf. Sebelumnya peralatan kaca dicuci bersih, kemudian ditiriskan hingga kering. Setelah kering masing-masing dibungkus dengan alumunium foil, untuk erlenmeyer dan tabung reaksi ditutup dengan kapas dan dibungkus dengan alumunium foil. Setelah itu disterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121 o C selama 15 menit. Sterilisasi dengan autoclave pada dasarnya menggunakan uap air panas bertekanan. Sedangkan peralatan yang tidak tahan panas disterilkan dengan larutan khlorin 150 ppm selama 24 jam. Kemudian dibilas dengan air tawar hingga bersih dan bau khlorin hilang. B. Persiapan Azolla pinnata Azolla pinnata yang akan digunakan sebagai pupuk untuk penelitian diperoleh dari sawah di areal kolam lele di desa kali pecabean - kecamatan Candi, Sidoarjo. Dikawasan tersebut Azolla pinnata sangat melimpah, oleh karena itu langsung dilakukan pemanenan. Proses berikutnya adalah dibilas dengan air bersih untuk menghilangkan kotoran kemudian dikeringkan dibawah sinar matahari sampai kering. Setelah Azolla pinnata kering kemudian digiling menjadi
serbuk, dan selanjutnya dilarutkan dalam akuades dengan perbandingan 1:4 yaitu 500 gram Azolla pinnata yang telah menjadi serbuk dengan 2 liter akuades. Hal ini berdasarkan penelitian pendahuluan yang telah dilakukan oleh Indarmawan (2011), pembuatan pupuk cair Azolla pinnata menggunakan perbandingan 1:4, bahwa dengan menggunakan perbandingan 1:4 Azolla pinnata sudah dapat tercampur dengan air dan hasilnya optimal. Setelah perendaman selama 4 minggu, Azolla pinnata yang telah direndam kemudian diperas menggunakan tangan secara manual agar cairan di dalamnya dapat keluar dan ditempatkan pada wadah gelas kaca yang steril dan tertutup agar tidak terkontaminasi. Sebelum digunakan dalam kultur, pupuk harus disaring secara berulang agar cairan dan endapan Azolla pinnata terpisah. C. Persiapan Skala Laboratorium teknis skala laboratorium yang digunakan sebagai media kultur adalah pupuk cair Azolla pinnata dan kontrol adalah pupuk Walne yang didapatkan dari BBPBAP Jepara. Menurut BBPBAP Jepara (2005) dalam Diahsari (2011), komposisi pupuk Walne adalah Na2EDTA 45 gr, NaH2PO4.H2O 20 gr, FeCl3.6H2O 1,5 gr, H3BO3 33,6 gr, MnCl2 0,36 gr, NaNO3 100 gr, traca metal solution 1 ml, vitamin ml, dan akuades 1 liter. Larutan pupuk yang telah siap disimpan dalam wadah yang tidak tembus cahaya. Larutan pupuk ini kemudian disterilkan dengan menggunakan autoclave.
D. Lingkungan dan Media Kultur Spirulina platensis Media kultur yang digunakan dalam penelitian adalah air laut sebanyak 1000 ml dan pupuk cair Azolla pinnata sesuai dengan konsentrasi yang ditentukan. Selanjutnya, media kultur diberi aerasi dan bibit Spirulina platensis dimasukkan dengan kepadatan 10 4 unit/ml (Suryati, 2002). Faktor-faktor lingkungan yang berpengaruh terhadap pertumbuhan fitoplankton antara lain, cahaya, suhu, salinitas dan ph air yang kemungkinan dapat mempengaruhi pertumbuhan Spirulina platensis, oleh karena itu lingkungan dikondisikan sama untuk setiap perlakuan. Lingkungan kultur S. platensis yang diharapkan dalam penelitian adalah suhu 25-29 o C, salinitas 30 ppt, ph 8-9 dan intensitas cahaya 2000 lux diukur dengan menggunakan lux meter (dengan meletakkan lampu TL 40 watt ±10 cm diatas media kultur) yang merupakan lingkungan kultur terbaik S. platensis. Photoperiod 12 jam dalam keadaan terang dan 12 jam dalam keadaan gelap (Santosa, 2010) E. Penebaran Bibit Spirulina platensis Spirulina platensis murni diperoleh dari Balai Besar Budidaya Pengembangan Air Payau Jepara. Bibit S. platensis dimasukkan ke dalam media dengan kepadatan 10 4 unit/ml. Suryati (2002) mengemukakan, kepadatan optimum untuk kultur Spirulina sp. adalah 10 4 unit/ml. Unit Spirulina sp. yaitu 1 panjang gelombang (1 lembah 1 gunung). Jika dalam akhir penghitungan terdapat jumlah pecahan maka dibuat patokan bahwa pecahan diatas 0,5 dibulatkan menjadi 1 dan pecahan dibawah 0,5 tidak ikut dihitung. Penghitungan jumlah bibit S. platensis untuk kultur menggunakan rumus (Edhy dkk., 2003):
V 1 N 2 V N 1 2 Keterangan: V1 = Volume bibit untuk penebaran awal (ml) N1 = Kepadatan bibit/ stock S. platensis (unit/ ml) V2 = Volume media kultur yang dikehendaki (ml) N2 = Kepadatan bibit S. platensis yang dikehendaki (unit/ ml) F. Perhitungan Pertumbuhan Populasi S. Platensis Penghitungan dilakukan dengan menggunakan Sedgewick Raffter. Pertama yang dilakukan adalah Sedgewick Raffter dibersihkan terlebih dahulu lalu dikeringkan menggunakan tissue, kemudian kaca penutup dipasang sedikit serong. Setelah itu, sampel diteteskan menggunakan pipet tetes, pengambilan sampel sebanyak ± 1ml, kemudian diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 100x. Selanjutnya, pertumbuhan Spirulina platensis dihitung berdasarkan satu sinusoid/gelombang artinya dalam satu gelombang terdapat satu lembah dan satu bukit. Dalam penghitungan juga digunakan Handtally Counter untuk memudahkan dalam menghitung. Pengamatan pertumbuhan S. platensis dilakukan setelah 24 jam penebaran awal setiap hari. Perhitungan dilakukan dengan rumus (Ekawati, 2005): Keterangan: N = Kepadatan S. platensis (unit/ ml) d = Diameter bidang pandang (mm) n = Jumlah rata-rata S. platensis per bidang pandang (unit/ ml)
G. Pengukuran Klorofil Pengukuran kndungan klorofil menggunakan metode yang berasal dari Vonshak (1997). Sebanyak 10 ml hasil kultur Spirulina platensis disentrifuge pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Hasil supernatan sentrifuge dibuang dan pellet Spirulina platensis yang berada didasar tube diekstraksi dengan 10 ml metanol absolut, didistrupsi dengan homogenezer dan diinkubasi pada suhu 70 o C selama 2 menit. Setelah itu campuran disentrifuge pada kecepatan 3000 rpm selama 5 menit, filtrat yang diperoleh diukur serapannya pada panjang gelombang 665 nm. (Koefisien absorbansi : 1,69). Klorofil (µg/l) = Koefisien Absorbansi x A 665 H. Pengukuran Kualitas Air Pengukuran kualitas air pada kultur Spirulina platensis dilakukan setiap hari. Parameter kualitas air yang diamati meliputi ph, suhu dan salinitas air. Pengukuran ph menggunakan ph meter, pengukuran suhu menggunakan termometer dan pengukuran salinitas menggunakan refraktometer. Pengukuran terhadap ph dan suhu dilakukan dua kali sehari pada pukul 06.00 dan 17.00 dan salinitas dilakukan sekali sehari selama masa pemeliharaan. Rak kultur ditutupi dengan plastik hitam, agar suhu ruang stabil dan untuk menghindari kontaminan. 4.3.3 Parameter Pengamatan A. Parameter utama Parameter utama dalam pada penelitian ini adalah pengukuran kandungan klorofil Spirulina plantensis yang dilakukan setelah panen ( ± 7 hari).
B. Parameter pendukung Parameter pendukung dalam penelitian ini adalah kepadatan Spirulina plantensis dan juga parameter kualitas air yang terdiri dari pengamatan suhu, ph dan salinitas. Pengukuran suhu dilakukan tiga kali sehari menggunakan termometer, pengukuran ph dilakukan tiga kali sehari menggunakan ph meter dan pengukuran salinitas dilakukan tiga kali sehari menggunakan refraktometer. 4.3.3 Analisis data Data penelitian utama dianalisis secara statistik dengan menggunakan ANAVA. Data yang dihasilkan bila terdapat perbedaan dapat dilakukan uji lanjutan. Uji lanjutan yang dapat digunakan adalah Uji Jarak Berganda Duncan (Duncan s Multiple Range Test) (Kusriningrum, 2008).
Persiapan Alat dan Bahan Kultur S. platensis A 1,5ml B 2,5ml C 3,5ml D 4,5ml E 5,5ml K Walne Kontrol 1 ml Penebaran Bibit S. platensis Pengamatan Kepadatan S. platensis dan parameter kualitas air Pengukuran kandungan klorofil Analisis data Gambar 7. Bagan Rancangan Penelitian