PEMBAHASAN Pangamatan morfologi sel menunjukkan bentuk sel batang, dan ada yang bulat. Sementara koloni bervariasi dari bentuk, tepian, elevasi dan warna. Hasil pewarnaan gram menunjukan bahwa ada isolat yang bersifat gram negatif dan ada juga yang bersifat Gram positif. Holt et al. (1994) mengemukakan bahwa kelompok bakteri denitrifikasi pada umumnya bersifar gram negatif, berbentuk bulat atau batang. Berdasarkan uji fermentasi glukosa semua isolat adalah bersifat non fermentatif karena tidak merubah substrat yang berwarna ungu menjadi kuning. Hal ini dikarenakan ketidakmampuan bakteri tersebut memproduksi asam pada media yang mengadung glukosa dalam kondisi anaerob hingga tidak terjadi perubahan warna. Sementara bakteri fermentatif dalam kondisi anaerob melakukan fosforilasi tingkat substrat dan menghasilkan asam organik. Asam organik menyebabkan ph media lebih rendah dan merubah warna brom cressol purple menjadi kuning. Rusmana dan Nedwell (2004) melaporkan bahwa proses denitrifikasi dilakukan oleh mikroorganisme dengan tipe metabolisme respirasi dan reduksi nitrat menjadi amonium dissimilatif (DNRA) dilakukan oleh kelompok bakteri dengan tipe metabolisme fermentatif. Lebih lanjut White (2000) menyatakan bahwa proses fermentasi memperoleh energi melalui fosforilasi tingkat substrat yang terjadi di sitosol menggunakan bahan organik seperti glukosa, asetat dan laktat sebagai penerima elektron dan sumber karbon. Sedangkan respirasi anaerob memperoleh energi melalui fosforilasi oksidatif pada membran sel menggunakan senyawa anorganik seperti nitrat, sulfat atau fumarat sebagai penerima elektron terakhir pengganti oksigen. Pertumbuhan isolat HNF5, LNF, NFR1 dan NFR4 pada uji pendahuluan dengan kondisi saturasi udara berbeda memperlihatkan pola yang sama yaitu semakin tinggi konsentrasi oksigen semakin baik pertumbuhannya. Hal ini dapat dilihat dari nilai Optical Density (OD). Pertumbuhan paling tinggi terjadi pada udara saturasi 100% sedangkan pertumbuhan paling rendah terlihat pada udara saturasi 0%. Dari keempat isolat yang diuji pertumbuhan paling tinggi adalah
30 NFR4, berarti isolat ini paling mampu beradaptasi dengan faktor lingkungan yang ada walaupun kurang responsif terhadap perubahan konsentrasi udara saturasi. NFR1 memiliki pertumbuhan yang baik dan rensponsif terhadap perubahan udara saturasi. Isolat HNF5 dan LNF kurang baik pertumbuhannya dan kurang responsif terhadap perubahan konsentrasi udara saturasi. Isolat NFR1 memperlihatkan pertumbuhan berbeda pada konsentrasi oksigen berbeda. Pada kadar oksigen rendah proses penguraian bahan organik lambat. Respirasi aerobik dengan oksigen sebagai akseptor elektron menghasilkan energi yang tinggi. Energi tinggi memacu pertumbuhan lebih cepat (Maier et al. 2000). Pada isolat terpilih NFR1dan NFR4 Pertumbuhan paling cepat terjadi pada udara saturasi 100%, dan paling lambat terjadi pada udara saturasi 1%. Perbedaan jelas terlihat pada isolat NFR1. Pada Isolat NFR4 walaupun pertumbuhan tidak besar perbedaannya tapi pada udara saturasi 100% sel masih terus tumbuh sampai akhir masa inkubasi. Diasumsikan walaupun isolat NFR1 dan NFR4 sama-sama anaerob fakultatif tetapi Isolat NFR1 menyukai lebih banyak oksigen dalam respirasinya. Terbukti pada saat konsentrasi oksigen rendah pertumbuhan menjadi lambat. Pada isolat NFR4 oksigen yang diperlukan sedikit, terlihat dari pertumbuhan yang hampir sama pada konsentrasi oksigan rendah maupun tinggi. Keberadaan akseptor elektron selain oksigen seperti nitrat, menimbulkan pengaruh terhadap jalur metabolisme oksidatif. Nitrat dapat dimanfaatkan sebagai akseptor elektron alternatif walaupun dalam kondisi aerobik (Carter et al. 1995). Medium yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri denitifikasi mengandung asetat sebagai sumber karbon dan nitrat sebagai penerima elektron terakhir. Menurut Teixera dan Olivera (2002), bakteri pereduksi nitrat heterotrof dapat hidup menggunakan senyawa organik sebagai sumber karbon misalnya asam asetat, asam propionat, asam benzoat, gliserol, metanol dan glukosa. Sedangkan nitrat digunakan sebagai alternatif penerima elektron terakhir dalam keadaan anaerob (Richardson 2000). Oksidasi molekul glukosa pada sistem metabolisme aerob akan berlangsung melalui lintasan glikolisis dan dilanjutkan dengan oksidasi piruvat menjadi CO 2 melalui siklus TCA. Gliserol akan masuk ke dalam lintasan glikolisis melalui pembentukan gliseraldehida-3-fosfat. Sedangkan asetat akan masuk ke dalam
31 siklus TCA setelah diubah menjadi asetil-coa (Prescott et al. 2000). Oksidasi akan menghasilkan ATP, NADH, dan FADH 2. Perolehan energi yang lebih banyak akan mendukung pertumbuhan sel. Semakin banyak Oksigen sebagai akseptor elektron dari donor maka proses oksidasi akan lebih cepat sehingga pertumbuhan akan lebih cepat. Aktivitas dan kecepatan isolat dalam mereduksi nitrat berbanding lurus dengan tingkat laju pertumbuhannya. Pertumbuhan isolat pada media sangat tergantung pada kemampuan beradaptasi dengan lingkungan. Faktor nutrien dan kemampuan kompetisi yang rendah dapat menghambat proses adaptasi tersebut. Setelah 96 jam waktu inkubasi pada uji reduksi nitrat untuk seleksi isolat terlihat Isolat HNF 5 dan LNF memiliki kemampuan yang hampir sama, dimana nitrat yang tereduksi hampir 100% (49,42 mm) untuk semua konsentrasi udara saturasi. Pada Isolat NFR1 dan NFR4 nitrat yang direduksi lebih sedikit, tetapi terlihat perbedaan aktivitas reduksi nitrat pada saturasi udara berbeda. Perbedaan kemampuan mereduksi nitrat pada semua isolat terkoleksi disebabkan oleh perbedaan aktivitas dari masing- masing isolat. Kemampuan isolat dalam mereduksi nitrat ditunjukkan oleh penurunan konsentrasi senyawa nitrat dalam medium pertumbuhan. Penurunan senyawa nitrat diduga disebabkan penggunaan nitrat sebagai akseptor elektron alternatif pengganti oksigen dalam rantai respirasi pada kondisi oksigen terbatas. Bakteri denitrifikasi dapat menggunakan nitrat, nitrit, nitrit oksida atau nitrous oksida sebagai penerima elektron terakhir alternatif untuk mendapatkan energi (Richardson 2000). Kemampuan isolat NFR1 mereduksi nitrat tidak terlalu tinggi dibanding isolat lain tetapi isolat NFR1 lebih responsif terhadap perbedaan konsentrasi udara saturasi. Isolat NFR4 memiliki pertumbuhan paling baik, kemampuan mereduksi nitratnya tinggi dan responsif terhadap perbedaan konsentrasi oksigen. Hal ini dapat dilihat pertumbuhan dan aktivitas reduksi nitrat yang berbeda pada saturasi udara berbeda. Isolat HNF5 dan LNF mempunyai kemampuan mereduksi nitrat yang tinggi tetapi tidak responsif terhadap perbedaan konsentrasi oksigen. Perbedaan kemampuan mereduksi nitrat pada semua isolat disebabkan oleh adanya perbedaan aktivitas masing-masing isolat. Selain itu perbedaan kadar nitrat yang direduksi pada masing-masing isolat menunjukkan banyaknya elektron
32 yang dapat diperoleh pada oksidasi senyawa karbon yang tersedia dalam medium karena kelompok bakteri ini menggunakan nitrat sebagai penerima elektron terakhir pada kondisi anaerob. Elektron yang diperoleh dari oksidasi senyawa karbon tersimpan pada molekul NADH dan FADH 2 yang berperan sebagai donor elektron pada rantai respirasi (Madigan et al. 2009; White 2000). Pada isolat NFR1 akumulasi nitrit terjadi fluktuatif selama inkubasi sedangkan pada isolat NFR4 akumulasi nitrit tertinggi pada jam ke 12. Menurut Balszcyk (1993) akumulasi nitrit dapat disebabkan oleh kompetisi penggunaan nitrat sebagai akseptor elektron, adanya penghambatan nitrit reduktase karena okumulasi NO. Tidak seimbangnya reaksi reduksi untuk katalisasi nitrat dan nitrit olah enzim reduktase serta terlambatnya induksi nitrit reduktase dibanding nitrat reduktase diperkirakan dapat juga menyebabkan akumulasi nitrit. Pada medium minimal induksi nitrat reduktase lebih awal sedangkan induksi nitrit reduktase terlambat untuk beberapa jam sampai beberapa hari. Penghambatan nitrit oksida reduktase oleh nitrat karena nitrat lebih kompetitif sebagai akseptor elektron dibanding nitrit Pada Isolat NFR4 akumulasi nitrit terlihat pada 12 jam waktu inkubasi dan mulai menurun pada jam ke 24 dan akhirnya habis. Diperkirakan pada isolat ini nirit segera direduksi menjadi gas NO, N 2 O atau N 2. Pada kondisi oksigen terbatas kelompok bakteri denitrifikasi akan aktif mereduksi nitrat menjadi nitrit, nitrit oksida, nitrous oksida dan dinitrogen (Paul dan Clark 1996). Bakteri denitrifikasi lebih kompetitif hidup dilingkungan oksigen rendah, tetapi ada juga beberapa proses denitrifikasi berlangsung aerobik (Hallin dan Lindren 1999; Zumf 1999). Dari uji terlihat pada kedua isolat nitrit terbanyak dihasilkan pada konsentrasi udara saturasi 1% dan yang paling sedikit dihasilkan pada udara saturasi 100%. Reduksi nitrat pada bakteri denitrifikasi melibatkan beberapa tahap reaksi yang dikatalis enzim. Terdapat dua enzim yang mengkatalis tahap pertama tahap reduksi nitrat menjadi nitrit, yaitu periplasmic nitrate reductase (Nap) dan membrane-bound nitrate reductase (Nar). Patureu et al. (1994) menjelaskan bahwa beberapa bakteri denitrifikasi dapat menggunakan senyawa nitrat dengan aktivitas enzim Nap melalui denitrifikasi aerobik maupun anaerobik. Aktivitas enzim Nar berhubungan langsung dengan proses respirasi pembentukan ATP,
33 sedangkan enzim Nap tidak langsung. Ekspresi gen nar dipengaruhi oleh ketersediaan oksigen dan nitrit sedangkan untuk gen nap tidak (Moreno-Vivian et al. 1999). Jenis enzim yang mengkatalis reduksi nitrit menjadi nitrit oksida yaitu cytochrome cd 1 nitrate reductase (NirS) dan copper nitrite reductase (NirK). Reaksi perubahan nitrit oksida menjadi nitrous oksida dikatalis enzim nitric oxide reductase (Nor) dan nitrous oksida menjadi dinitrogen dikatalis nitrous oxide reductase (Nos) (Zumf et al.1997; Richardson 2000). Berdasarkan hasil sekuensing 16S-rRNA yang dilakukan Marnis (2008) isolat NFR1mempunyai kemiripan dengan Microbacterium sp (95%). Sementara NFR4 mempunyai kemiripan dengan Shewanella algae (95%). Richardson (2001) mengemukakan Microbacterium sp memiliki gen nar yang berfungsi untuk mereduksi senyawa nitrat dan tidak memiliki gen nos untuk mereduksi nitrous oksida menjadi dinitrogen. Bakteri Shewanella algae memiliki gen nas dan nap dalam melakukan aktivitas reduksi nitrat. Pada isolat NFR1 tidak dihasilkan amonium, bahkan amonium berkurang dibandingkan dengan media awal. Penurunan konsentrasi senyawa amonium diduga disebabkan penggunaan amonium oleh isolat NFR1 sebagai sumber nitrogen dan sumber energi. Penggunaan senyawa amonium sebagai sumber N melalui proses assimilasi, dimana amonium diubah menjadi senyawa nitrogen organik untuk sintesis material sel. Isolat NFR4 menghasilkan amonium. Amonium tertinggi dihasilkan pada jam ke 36 dan setelah jam ke 48 amonium berkurang dan habis. Diduga pada bakteri ini terdapat enzim Nfr yang dapat mereduksi nitrat menjadi amonium. Zumf (1992) mengemukakan bakteri denitrifikasi memanfaatkan senyawa nitrat atau nitrit sebagai penerima elektron terakhir dalam proses metabolismenya. Sebagai produk akhir dari metabolisme tersebut adalah gas nitrogen seperti nitrit oxida, nitrous oxida atau dinitrogen, namun pada beberapa bekteri pereduksi nitrat ada yang menghasilkan amonium. Krause dan Nealson (1997) menambahkan bahwa pada Shewanella reduksi nitrat ke amonium merupakan fisiologi tambahan. Bila bakteri ini berada pada potensial redoks yang tinggi menggunakan glukosa sebagai sumber karbon Shewanella putrefacien dapat mereduksi nitrat menjadi
34 amonium (Samuelsson 1985; Samuelsson 1988). Amonium semakin berkurang diduga karena dimanfaatkan oleh bakteri untuk pertumbuhan dan membangun struktur sel (Maier 2000). Amonium tertinggi dihasilkan pada konsentrasi udara saturasi 1% dan terendah pada konsentrasi udara saturasi 100%. Diduga walaupun enzim Nfr tidak langsung dipengaruhi oleh konsentrasi oksigen tetapi hasil reduksi sebelumnya oleh enzim Nar dan Nap menyebabkan pada konsentrasi amonium juga ikut terpengaruh. Pada isolat ini konsentrasi udara saturasi yang rendah menyebabkan gen nfr mengekspresikan enzim Nfr yang umumnya dimiliki oleh bakteri DNRA Sistem metabolisme tiap isolat sangat beragam. Hal ini terlihat dari kemampuan bakteri dalam menghasilkan gas. Banyaknya gas yang dihasilkan berbanding terbalik dengan nitrit dan amonium. Semakin banyak amonium dan nitrit yang terbentuk berarti akan makin sedikit gas yang dihasilkan, begitu pula sebaliknya. Semua isolat denitrifikasi yang diujikan menghasilkan gas pada aktivitas reduksi nitrat. Widiyanto (2006) menyatakan kemampuan masingmasing isolat denitrifikasi mempunyai spesifikasi yang berbeda dalam mereduksi senyawa nitrat dan memproduksi gas nitrogen. Denitrifikasi adalah merupakan proses perubahan nitrat menjadi nitrous oksida dan gas nitrogen pada kondisi oksigen yang terbatas (Richardson 2000; Moreno-Vivian et al.1999). Banyak dan macam gas yang dihasilkan tergantung kepada kelengkapan enzim yang dimiliki bakteri tersebut serta faktor lingkungan yang turut mempengaruhinya. Rumana (2003a) telah mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri-bakteri dari sedimen estuari yang memiliki metabolisme berbeda. Comomonas testosteroni mampu mereduksi nitrat menjadi N 2, Shewanella putrefacien mereduksi nitrat hanya sampai N 2 O, berarti tidak mempunyai gen nos yang berperan dalam mereduksi N 2 O menjadi N 2. Hal ini menunjukkan kemungkinan isolat perlakuan memiliki produk akhir berupa N 2 O. Walaupun NFR1 dan NFR4 diperkirakan menghasilkan N 2 O tetapi jumlah dan perbandingannya dengan gas lain dipengaruhi berbagai faktor antara lain bahan organik, suhu dan oksigen. Enzim nitrat dan nitrit reduktase hanya diekspresikan ketika konsentrasi oksigen tidak lebih tinggi dari 2,5-5% yang mana Nitrous oksida reduktase diekspresikan ketika O 2 tidak lebih tinggi dari 5%
35 (Korner dan Zumf 1989). Kester (1997) berdasarkan percobaannya dengan bakteri denitrifikasi Alcaligenes eutropus dan Pseudomonas stutzeri menggunakan medium asetat pada konsentrasi udara saturasi 0%,1%, 5%,10% dan 80% menyatakan NO 2, NO, N 2 O terbanyak ditemukan pada konsentrasi udara saturasi 0%. Enzim-enzim pada proses reduksi nitrat paling aktif dibawah kondisi anaerobik walaupun beberapa organisme diketahui melakukan respirasi O 2 dan denitrifikasi secara bersamaan (McKenney 2001). Hernandes (1998) menambahkan oksigen menghambat reduksi nitrat dan dinitrogen melalui tiga tingkatan, yaitu dengan menekan sintesis sistem enzim yang mengkatalis reduksi nitrat, mengganggu kerja sistem enzim pada bakteri dan mengalihkan aliran elektron dari satu sistem respirasi (nitrat) ke yang lainya (oksigen). Isolat NFR4 mereduksi nitrat lebih lambat dari NFR1. Isolat NFR4 diisolasi oleh Marnis (2008) dari medium dengan konsentrasi nitrat rendah. Isolat NFR4 memiliki kemiripan dengan Shewanella algae diduga memiliki gen nap yang mengekspresikan enzim Nap. Enzim Nap lebih kompetitif pada nitrat yang rendah, dan tidak dipengaruhi oleh kehadiran oksigen sehingga dalam aktivitas reduksi nitrat perbedaan konsentrasi oksigen tidak terlalu berpengaruh nyata. Nap aktif dalam konsisi aerob dan anaerob. Enzim ini tidak langsung berhubungan dengan proton motion force (PMF). Beberapa bakteri menggunakan Nap pada respirasi aerobik untuk mendukung pertumbuhan dan Nap berfungsi untuk menyeimbangkan reaksi redoks untuk pertumbuhan yang optimal (Moreno-Vivian 1999; Rusmana 2003a). Denitrifikasi aerobik sangat penting pada organisma yang hidup pada lingkungan mikroaerobik atau pada lingkungan yang cepat berubah antara aerobik dan anaerobik. Nap memegang peranan penting untuk beradaptasi pada kondisi anaerobik dari kondisi aerobik dan mencegah akumulasi nitrit tinggi yang dapat menghambat pertumbuhan (Zumf 1997; Richardson et al. 2001). Isolat NFR1 yang diisolasi dari medium dengan konsentrasi nitrat tinggi (Marnis 2008), diduga memiliki enzim Nar. Nar lebih komptitif pada konsentrasi nitrat yang tinggi dan dipengaruhi oleh keberadaan oksigen sehingga perbedaan konsentrasi oksigen perpengaruh terhadap aktivitas reduksi nitrat isolat ini. Kecepatan reduksi nitrat setiap sel tinggi pada konsentrasi oksigen rendah dan
36 lambat pada konsentrasi oksigen tinggi. Hal ini disebabkan pada konsentrasi oksigen rendah nitrat digunakan sebagai akseptor elektron untuk menghasilkan energi. Enzim Nar membangkitkan PMF melalui membran yang diikuti sintesis ATP. Enzim Nar disintesis selama pertumbuhan anaerobik melalui protein Fnr pada lingkungan yang mengandung nitrat dan nitrit. Pada kondisi anoksik Fnr mengikat ke DNA dan mengaktivasi transkripsi nar dan gen-gen lain untuk metabolisme anaerobik. Pada kondisi aerobik [4Fe-2S] 2+ dikonversi menjadi [3Fe- 2S] 2+ atau [2Fe-2S] 2+ sehingga Fnr tidak aktif (Moreno-vivian et al. 1999; Richardson et al. 2001).