3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan Desember 2011 sampai Juli 2012. Penelitian sifat kimia buah lindur dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, FPIK IPB. Penelitian jaringan buah lindur dilakukan di Laboratorium Jaringan Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Pembuatan tepung buah lindur dan pembuatan biskuit dilakukan di Laboratorium Preservasi dan Pengolahan Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, FPIK IPB. Analisis fisik dan kimia tepung buah lindur dilakukan di Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, FPIK IPB dan Laboratorium Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian, Cimanggu Bogor. Analisis fisik, kimia, dan biologi biskuit lindur dilakukan di Laboratorium Biokimia Departemen Teknologi Pangan dan Gizi Fateta IPB, Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan adalah buah lindur (B. gymnorrhiza) yang tidak cacat fisik dan busuk, memiliki panjang 10-25 cm, diameter 1-2 cm, berat rata-rata 53 gram, dan berwarna hijau tua. Buah lindur yang digunakan pada penelitian ini dapat dilihat pada Lampiran 1. Bahan-bahan pembuatan biskuit adalah tepung buah lindur, margarin, susu bubuk, baking powder, air, telur, vanili, dan bahan-bahan kimia lain yang digunakan untuk analisis. Alat yang digunakan adalah mikroskop merk Olympus BH-2, beaker glass 2 L, oven, talenan, cetakan, baskom, mixer, parutan kelapa, ayakan 100 mesh, loyang, blender, chromameter CR-200, texture analyzer XT-2i, tabung reaksi, cawan alumunium, cawan porselen, soxhlet, labu kjeldahl, timbangan analitik, desikator, gelas piala, gegep, gelas ukur, pemanas air, dan kertas saring.
11 3.3 Metode Penelitian Penelitian ini terdiri dari penelitian pendahuluan dan penelitian lanjutan. Penelitian pendahuluan dilakukan untuk menentukan penambahan tepung buah lindur yang optimal. Diagram alir penelittian secara keseluruhan dapat dilihat pada Gambar 3. Bahan baku Karakterisasi Bahan Baku Analisis Fisika - kimia Pembuatan tepung Tepung lindur Pembuatan biskuit Analisis jaringan Kadar air Kadar lemak Kadar abu Kadar protein Kadar karbohidrat Biskuit Analisis biskuit Gambar 3 Diagram alir penelitian. 3.3.1 Karakterisasi bahan baku Bahan baku buah lindur yang dipilih untuk pembuatan tepung adalah yang sehat dan berkualitas baik, yaitu tidak cacat fisik dan tidak busuk. Bahan baku dievaluasi sifat fisik dan kimianya. Analisis yang digunakan untuk mengetahui karakterisitik buah lindur yaitu analisis jaringan dan kimia yang terdiri dari rendemen, kadar abu, kadar air, kadar protein, kadar lemak, dan kadar HCN. 3.3.2 Pembuatan tepung buah lindur Buah lindur yang telah dipilih kemudian dicuci dan direbus, hal ini untuk membantu proses pengupasan kulit karena buah lindur memiliki kulit yang keras. Buah lindur yang telah dikupas kemudian direndam dengan air bersih, Perendaman bertujuan untuk melarutkan HCN dan tanin yang terdapat pada buah lindur. Proses selanjutnya adalah penirisan dan pemarutan untuk mempercepat proses pengeringan. Hasil pemarutan diperas terlebih dahulu sebelum dikeringkan, untuk mengeluarkan sisa air yang terdapat pada buah lindur.
12 Pengeringan dilakukan dengan oven pada suhu 80 0 C selama 3 jam, lalu dilanjutkan dengan penggilingan dan diayak dengan ayakan 100 mesh (Suprapti 2003). Proses pembuatan tepung buah lindur dapat dilihat pada Gambar 4. Buah lindur Penyortiran Pencucian dan perebusan hingga mendidih * Pengupasan Perendaman dan penirisan Penjemuran Perebusan Pemarutan dan penirisan Pengeringan dengan oven (80 0 C, 3 jam) * Penggilingan dan pengayakan (100 mesh) * Tepung buah lindur Gambar 4. Diagram alir pembuatan tepung buah lindur (Dimodifikasi dari Suprapti 2003).
13 Analisis tepung buah lindur yang dihasilkan meliputi sifat fisik dan kimia tepung buah lindur. Sifat fisik tepung buah lindur yang akan dianalisis adalah warna. Analisis warna menggunakan metode hunter dengan alat chromameter CR-200. Sistem notasi warna yang digunakan adalah nilai L, a, b, dan 0 Hue. Nilai L menunjukan kecerahan warna tepung, sedangkan nilai a dan b merupakan pengukuran warna kromatik. Analisis sifat kimia tepung buah lindur meliputi proksimat untuk mengetahui kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, kadar karbohidrat by difference, kandungan mineral, dan kadar HCN. 3.3.3 Pembuatan biskuit lindur Biskuit yang dibuat pada penelitian ini terdiri dari biskuit kontrol dan biskuit lindur. Biskuit kontrol dengan menggunakan tepung terigu 100%, sedangkan biskuit lindur dibuat menggunakan tepung lindur dan tepung terigu dengan perbandingan tepung lindur : tepung terigu, antara lain 40%:60% (H716), 50%:50% (N290), 60%:40% (Z315), dan 70%:30% (U867). Analisis yang dilakukan pada biskuit yang dihasilkan adalah uji organoleptik berupa uji hedonik dengan menggunakan score sheet. Skor penilaiannya adalah 1 (amat sangat tidak suka) sampai 7 (sangat suka) yang meliputi penampakan, warna, tekstur, rasa, dan aroma kemudian dilakukan uji mutu biskuit untuk biskuit terpilih. Proses pembuatan biskuit dimodifikasi dari Hiswaty (2002) pada penelitian pendahuluannya. Formula yang dimodifikasi berupa penambahan air dan karagenan pada adonan serta pengurangan konsentrasi garam. Trial and error proses pemanggangan biskuit disajikan pada Lampiran 2. Formula tersebut dapat dilihat pada Tabel 2 dan proses pembuatannya dapat dilihat pada Gambar 5. Tabel 2 Formula biskuit Bahan Komposisi (gram) Hiswaty (2002) Tepung 100 100 Tepung gula 30 20 Kuning telur 10 10 Mentega 35 35 Susu full cream 2,5 2,5 Baking powder 0,2 0,2 Vanili 1 1 Garam 0,5 1 Karagenan 1 - Sumber : Dimodifikasi dari Hiswaty (2002)
14 Hasil uji hedonik berfungsi untuk menentukan biskuit pilihan panelis yang akan dilakukan analisis lebih lanjut, antara lain analisis proksimat (kadar air, abu, protein, lemak, dan karbohidrat), kadar serat kasar, kadar FFA, tingkat kekerasan, uji TPC, dan koliform. Berdasarkan hasil uji organoleptik, uji fisik dan uji kimia maka dapat ditentukan penambahan tepung buah lindur yang optimal dari segi nilai gizi dan penerimaan konsumen. Margarin, tepung gula, kuning telur Tepung terigu * (60%, 50%, 40%, 30%) Tepung buah lindur * (40%, 50%, 60%, 70%) Susu full cream Vanili Baking powder Air * Garam Karagenan * Pengocokan Pencampuran hingga merata * Pengadukan hingga terbentuk adonan Pencetakan Pemanggangan Pada suhu 135 o C selama 20 menit * Biskuit Gambar 5 Diagram alir pembuatan biskuit (Dimodifikasi dari Hiswaty 2002). 3.3.4 Pengamatan Pengamatan yang dilakukan pada penelitian ini meliputi analisis kimia, analisis fisik dan biologi. Analisis kimia yang diamati antara lain kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, kadar karbohidrat, kandungan HCN, kandungan mineral, kadar serat kasar, asam lemak bebas (FFA), dan nilai kalori. Analisis fisik yang diamati antara lain analisis jaringan, analisis warna tepung buah lindur, dan kekerasan biskuit. Analisis biologi yang diamati antara lain TPC dan koliform.
15 1) Analisis jaringan Pemeriksaan jaringan tumbuhan lindur dilakukan dengan menggunakan metode parafin. Analisis ini dilakukan terhadap buah lindur. Tahapan persiapan preparat dengan metode parafin diantaranya adalah fiksasi, dehidrasi, penjernihan, penanaman, penyayatan, penempelan sayatan, dan pewarnaan. Diagram alir pembuatan preparat dengan metode parafin disajikan pada Gambar 6. Tumbuhan lindur Pemotongan Fiksasi FFA Pencucian dengan etanol Infitrasi dengan parafin Penanaman dengan parafin Penyayatan blok parafin Perekatan dengan gelas objek Pewarnaan Pengamatan dengan mikroskop Gambar 6 Diagram alir pembuatan preparat dengan metode paraffin. 2) Uji organoleptik Uji organoleptik terhadap biskuit dilakukan dengan menggunakan uji hedonik atau uji kesukaan. Analisis ini menggunakan score sheet dengan skor penilaiannya dari 1 (amat sangat tidak suka) hingga 7 (sangat suka) yang meliputi
16 penampakan, warna, tekstur, rasa, dan aroma kemudian dilakukan uji mutu biskuit untuk biskuit terpilih. Uji ini dilakukan dengan menggunakan 30 panelis. Score sheet uji hedonik biskuit lindur dapat dilihat pada Lampiran 3. 3) Analisis warna tepung lindur Analisis warna menggunakan metode hunter Lab dengan alat chromameter CR-20. Sistem notasi warna yang digunakan adalah nilai L, a, b, dan 0 Hue. Nilai L menunjukkan kecerahan warna tepung, sedangkan nilai a dan b merupakan pengukuran warna kromatik. 4) Kekerasan biskuit (Fardiaz 1987) Pengukuran kekerasan biskuit dilakukan dengan menggunakan texture analyzer XT-2i yang dinyatakan dalam satuan gf (gram force). Pengukuran kekerasan berhubungan dengan kerenyahan biskuit, yaitu mudah atau tidaknya biskuit biskuit menjadi remuk. Probe yang digunakan adalah probe bola (spherical). Jarak probe dikalibrasi sesuai dengan tinggi biskuit. Biskuit yang akan diukur kekerasannya diletakkan di bawah probe, lalu tekan Quick Run Test. Nilai kekerasan biskuit dapat dilihat pada layar komputer. 5) Analisis kadar air (AOAC 2005) Analisis kadar air dilakukan dengan penguapan menggunakan oven. Tahap pertama yang dilakukan adalah mengeringkan cawan porselen pada suhu 105 o C selama 1 jam. Cawan tersebut diletakkan dalam desikator kurang lebih 15 menit hingga dingin kemudian ditimbang. Sampel buah lindur ditimbang sebanyak 5 gram lalu dihomogenkan. Sampel yang telah dihomogenkan dimasukkan ke dalam cawan porselen. Cawan porselen beserta sampel ke dalam oven dengan suhu 105 o C selama 6 jam. Setelah 6 jam cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator hingga dingin kemudian ditimbang bobotnya. % kadar air = B C B A x 100% Keterangan: A= Berat cawan porselen kosong (gram) B = Berat cawan porselen dengan sampel (gram) sebelum dioven C= Berat cawan porselen dengan sampel (gram) setelah dioven
17 6) Analisis kadar abu (AOAC 2005) Analisis kadar abu dilakukan dengan mengabukan sampel di dalam tanur. Tahap pertama cawan abu porselen dikeringkan di dalam oven selama 1 jam dengan suhu 105 o C, lalu didinginkan 15 menit di dalam desikator kemudian ditimbang. Sampel buah lindur ditimbang sebanyak 5 gram lalu dihomogenkan. Sampel buah lindur yang telah dihomogenkan dimasukkan ke dalam cawan abu porselen. Cawan porselen beserta sampel buah lindur didalamnya dipijarkan dalam tungku pengabuan bersuhu 105 o C sampai tidak berasap. Selanjutnya cawan tersebut dimasukkan kedalam tanur pada suhu 600 o C selama 6 jam sampai abu berwarna putih dan berat konstan. Setelah itu cawan abu porelin didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang bobotnya. Perhitungan kadar abu: % kadar abu = C A B A Keterangan: A = Berat cawan porselen kosong (gram) B = Berat cawan porselen dengan sampel (gram) sebelum ditanur C = Berat cawan porselen dengan sampel (gram) setelah ditanur 7) Analisis kadar protein (AOAC 2005) x 100% Tahap tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap yaitu destruksi, destilasi dan titrasi. Pertama tama, sampel dimasukkan sebanyak 1 gram ke dalam tabung kjelhdal. Selanjutnya ditambahkan 10 ml H 2 SO 4 p.a 98% ke dalam tabung tersebut. Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 400 o C. Proses dekstruksi dilakukan sampai larutan berwarna bening (Tahap destruksi). Selanjutnya isi labu dituangkan ke dalam labu destilasi, lalu dimasukkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan larutan NaOH 50% sebanyak 10 ml. Cairan dalam ujung tabung kondensor ditampung dalam Erlenmeyer 125 ml berisi larutan H 3 BO 3 indikator yang ada di bawah kondensor. Destilasi dilakukan sampai diperoleh 200 ml destilat yang bercampur dengan H 3 BO 3 indikator dalam erlenmeyer (Tahap destilasi). Terakhir dilakukan titrasi menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan Erlenmeyer berubah menjadi pink. Kadar protein ditentukan dengan rumus:
18 % N = ml HCl ml HCl blanko x 0.1 N HCl x 14.007 mg sampel 100% 8) Analisis kadar lemak (AOAC 2005) Kadar protein = % N x 6,25 Lemak adalah senyawa yag larut dalam pelarut nonpolar. Sifat kelarutan lemak sangat tergantung pada strukturnya. Metode yang sering digunakan di laboratorium adalah metode ekstraksi sokhlet, yakni secara langsung mengekstraksi lemak dari bahan dengan pelarut organik non polar, misalnya heksana, petroleum eter, dan dietil eter. Sampel seberat 5 gram (W1) dimasukkan ke dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W2) dan disambungkan dengan tabung sokhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang reaktor tabung sokhlet dan disiram dengan pelarut lemak. Tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi sokhlet lalu dipanaskan pada suhu 40 o C dengan pemanas listrik selama 16 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 o C, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan (W3). Perhitungan kadar lemak yaitu : % Kadar lemak = W3 W2 W1 100% Keterangan: W1 = berat sampel (g) W2 = berat labu lemak tanpa lemak (g) W3 = berat labu lemak dengan lemak (g) 9) Analisis karbohidrat (AOAC 2005) Pengukuran kadar karbohidrat dilakukan secara by difference, yaitu hasil pengurangan dari 100% dengan kadar air, abu, protein, dan lemak sehingga kadar karbohidrat tergantung pada faktor pengurangan. Kadar karbohidrat dapat dihitung mengunakan rumus: Karbohidrat (%) = 100% - (% air + % abu + % protein + % lemak )
19 10) Kadar serat kasar (BSN 1992) Sampel sebanyak 1 g contoh yang telah bebas dari lemak ditimbang, lalu dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 750 ml, kemudian ditambah 100 ml H 2 SO 4 1,25%, dan didihkan selama 30 menit. Sampel tersebut kemudian ditambahkan lagi 200 ml NaOH 3,25%, lalu didihkan selama 30 menit. Dalam keadaan panas sampel disaring dengan menggunakan corong Buchner berisi kertas saring yang telah diketahui bobotnya (lebih dahulu dikeringkan pada 105 o C selama ½ jam). Kertas saring dicuci berturut-turut dengan air panas, H 2 SO 4 1,25%, air panas, dan alkohol 96%. Kertas saring dengan isinya diangkat dan dimasukkan ke dalam cawan pijar yang telah diketahui bobotnya, lalu dikeringkan pada 105 o C selama 1 jam hingga bobot tetap. Setelah itu cawan seisinya diabukan dan dipijarkan, akhirnya ditimbang sampai bobot tetap. Kadar serat kasar = A B C bobot conto h x 100 % Dimana : A: bobot cawan + kertas saring + isi B: bobot abu + cawan C: bobot kertas saring 11) Asam lemak bebas (FFA) (BSN 2011) Sampel minyak atau lemak sebanyak 10 gram yang diperoleh dari biskuit ditambahkan ke dalam 50 ml etanol netral 95%, kemudian dipanaskan selama 10 menit dalam penangas air sambil diaduk lalu didinginkan. Setelah didinginkan, sampel ditambah 2 ml larutan fenolftalein kemudian dititrasi dengan NaOH 0,1 N sampai berwarna merah jambu. Rumus yang digunakan untuk menghitung kadar FFA adalah : % FFA = 28,2 x ml NaOH x n NaOH x bobot mole kul Gram sampel x 1000 x 100% 12) Nilai kalori (BSN 1992) Nilai kalori per 100 g contoh = (9 x % lemak + 4 x % protein + 4 x % karbohidrat) kal 13) Uji Total Plate Count (TPC) (Fardiaz 1987) Pembuatan larutan contoh dilakukan dengan cara mencampurkan 10 ml sampel dengan 90 ml larutan garam fisiologis sampai larutan menjadi homogen
20 sehingga terbentuk pengenceran 10-1. Pengenceran dilakukan dengan cara mengambil 1 ml larutan contoh yang sudah homogen dengan pipet steril, lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan garam fisiologis sehingga terbentuk pengenceran 10-2, kemudian larutan tersebut dikocok sampai homogen. Pengenceran dilakukan menurut kebutuhan penelitian, masing-masing tabung pengenceran dipipet sebanyak 1 ml larutan contoh dan dipindahkan ke dalam cawan petri steril secara duplo menggunakan pipet steril. Media agar ditambahkan ke dalam setiap cawan petri sebanyak 10 ml dan digoyangkan sampai merata. Setelah agak membeku, cawan petri diinkubasi dengan posisi terbalik dalam inkubator bersuhu 35 o C. Jumlah koloni mikroba dalam cawan petri dihitung dengan pemilihan cawan petri yang mempunyai koloni antara 30-300 koloni. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama dan angka kedua setelah koma kemudian dikalikan dengan satu per faktor pengencerannya. Jika angka yang ketiga sama atau lebih besar dari 5, maka dibutuhkan satu angka lebih tinggi dari angka kedua. Jumlah koloni yang dapat dihitung adalah sebagai berikut : Koloni per ml/gram = koloni = 1 Faktor Pengenceran 14) Uji total bakteri koliform (BSN 1992) Analisis terhadap koliform dilakukan dengan menggunakan metode Angka Paling Memungkinkan/APM (Most Probable Number/MPN) seri 3 tabung, yaitu dengan mengamati keberadaan gas yang terbentuk dalam tabung Durham. Prosedurnya dimulai dengan mengencerkan sebanyak 25 gram sampel ke dalam 225 ml BPW (P-1), pengenceran dilakukan hingga 10-3 (P-3). Sebanyak 1 ml sampel dari masing-masing pengenceran diambil dan dipindahkan ke dalam tabung yang berisi 5 ml Lactose Broth yang telah disediakan dengan menggunakan pipet steril, tiap pengenceran disediakan 3 tabung reaksi dan di dalam masing-masing tabung reaksi diletakkan tabung Durham dengan posisi terbalik. Semua tabung diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24-48 jam. Jumlah tabung yang membentuk gas pada masing-masing pengenceran dicatat, kemudian
21 dikonversikan berdasarkan tabel yang telah ditetapkan untuk mendapatkan jumlah bakteri koliform (Lampiran 4). 3.3.5 Pengolahan data Penelitian ini menggunakan 4 perlakuan substitusi tepung lindur yang berbeda. Perlakuan yang digunakan pada pembuatan biskuit dengan substitusi tepung lindur ini, yaitu 40%, 50%, 60%, dan 70%. Masing-masing perlakuan substitusi tepung lindur dilakukan dengan 2 kali ulangan. Data yang diperoleh dari hasil organoleptik diolah menggunakan software SPSS untuk mengetahui hasil terbaik. Jika hasil uji Kruskal wallis menunjukkan nilai Asymp.Sig. < 0,05 maka perlu dilakukan uji lanjut Duncan dengan hipotesis berikut : H 0 : Perbedaan konsentrasi tepung lindur yang ditambahkan tidak memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap parameter rasa, warna, tekstur, penampakan, dan aroma biskuit. H 1 : Perbedaan konsentrasi tepung lindur yang ditambahkan memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap parameter rasa, warna, tekstur, penampakan, dan aroma biskuit. Hasil uji organoleptik yang terbaik akan diuji mutunya secara fisik, yaitu uji kekerasan, analisis kimia dan biologi. Analisis kimia meliputi analisis proksimat (kadar air, abu, protein, lemak, dan karbohidrat), nilai kalori, kadar serat kasar, dan asam lemak bebas. Analisis biologi meliputi uji TPC dan koliform.