18 3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari sampai April 2012. Pengambilan sampel dilakukan di Pantai Ekowisata Mangrove, Pantai Kapuk, Muara Karang, Jakarta Utara. Proses persiapan sampel, analisis fitokimia, dan analisis aktivitas antikosidan dilakukan di Laboratorium Bahan Baku Teknologi Hasil Perairan. Analisis proksimat (kadar air, abu, protein, dan lemak) dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan dan Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Uji kadar flavonoid total dilakukan di Laboratorium Kimia Analitik, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian daun dan kulit batang tumbuhan api-api (Avicennia marina) yang diperoleh dari Pantai Ekowisata Mangrove, Pantai Kapuk, Muara Karang, Jakarta Utara. Sampel daun api-api berasal dari pucuk daun dengan batasan antara ranting kedua dan kelima secara acak, dengan warna daun seragam yang kemudian dihomogenkan, sedangkan sampel kulit batang api-api diambil dengan ketinggian 160 cm di atas permukaan laut dengan batang tumbuhan api-api berdiameter 5-10 cm, warna batang daun putih kehijauan. Satu jenis pelarut yang digunakan dalam ekstraksi adalah metanol sebagai pelarut polar. Bahan kimia yang dipakai dalam uji aktivitas antioksidan adalah metode l,l-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), butylated hydroxytoluena (BHT) sebagai standar, dan methanol pro analisis sebagai pelarut. Bahan untuk uji fitokimia, yaitu H 2 SO 4, akuades, kloroform p.a, anhidra asetat, asam sulfat pekat, HCl 2 N, pereaksi Dregendorff, pereaksi Wagner, pereaksi Meyer, serbuk magnesium, alkohol, HCl 37 %, etanol 95 %, etanol 70 %, FeCl 3 5, AlCl 3 10 %, natrium asetat 1M. Alat-alat yang digunakan antara lain pisau, talenan, timbangan digital, sudip, gegep, cawan porselen, oven, desikator, tabung reaksi, gelas erlenmeyer,
19 tabung Kjeldahl, buret, mortar, kertas saring Whatman 42, alumunium foil, kompor listrik, corong kaca, pipet mikro, pipet tetes, gelas ukur, gelas piala, rotary vacuum evaporator, vortex, inkubator, penangas air, spektrofotometer UV- VIS, orbital shaker, kapas bebas lemak, tabung soxhlet, plastik, homogenizer, botol vial, waterbath, syringe dan alat penguji DPPH. 3.3 Prosedur Penelitian Rangkaian kegiatan penelitian meliputi pengambilan sampel tumbuhan api-api, preparasi sampel, dan analisis kimia yang terdiri atas uji proksimat dan fitokimia. Selanjutnya dilakukan ekstraksi dengan metode maserasi, uji kadar flavonoid total serta uji aktivitas antioksidan dengan DPPH. Proses penelitian secara umum dapat dilihat pada diagram alir Gambar 6. Kulit batang dan daun api-api Penjemuran alami selama ± 3 hari Penghalusan sampel Pengujian proksimat Pengekstraksian (1:3) (b/v) Maserasi selama 24 jam sebanyak 16 kali ulangan menggunakan metanol p.a Penyaringan Filtrat Residu Evaporasi Pengujian kualitatif fitokimia Pengujian kadar flavonoid total Pengujian aktivitas antioksidan Gambar 6 Proses penelitian secara garis besar
20 3.3.1 Pengambilan dan preparasi sampel Penelitian ini diawali dengan pengambilan sampel pohon api-api (Avicennia marina) dari Pantai Ekowisata Mangrove, Pantai Kapuk, Muara Karang, Jakarta Utara. Setelah sampel daun dan kulit batang pohon api-api diperoleh lalu dibawa dengan plastik ber-sealer, agar terhindar dari udara luar. Kemudian sampel dikeringkan di bawah sinar matahari selama kurang lebih 3 hari dengan paparan sinar matahari langsung dan diangin-anginkan pada malam hari untuk menjaga komponen aktif tidak ikut menguap saat pengeringan. Selanjutnya dilakukan preparasi untuk memisahkan perbagian kulit batang dan daun pohon api-api (Jacoeb et al. 2011). Setelah proses pengeringan, sampel dihancurkan sampai menjadi bagianbagian kecil atau serbuk agar memudahkan proses penapisan dan proses pengekstraksian. Untuk menjaga stabilitas dari kualitasnya, sampel disimpan dalam lemari pendingin yang dibungkus dengan plastik ber-sealer agar tetap terjaga dan terhindar dari kontaminan. 3.3.2 Analisis proksimat Analisis proksimat dilakukan untuk mengetahui kandungan gizi secara kasar (crude) yang meliputi kadar air menggunakan metode oven, abu menggunakan tanur, protein menggunakan metode Kjeldahl dan lemak menggunakan metode sokhlet. a) Analisis kadar air (AOAC 2005) Analisis kadar air yaitu untuk mengetahui kandungan atau jumlah air yang terdapat pada suatu bahan. Tahap pertama adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 105 0 C selama 1 jam. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (kurang lebih 15 menit) dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Sampel seberat 5 gram ditimbang dalam cawan, setelah terlebih dahulu dihaluskan. Selanjutnya cawan yang telah diisi sampel tersebut dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 102-105 0 C selama 5-6 jam. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator dan dibiarkan sampai dingin (30 menit) kemudian ditimbang.
21 Perhitungan kadar air : % Kadar air = B - C x 100% B - A Keterangan : A = Berat cawan kosong (gram) B = Berat cawan yang diisi dengan sampel (gram) C = Berat cawan dengan sampel yang sudah dikeringkan (gram) b) Analisis kadar abu (AOAC 2005) Analisis kadar abu yaitu untuk mengetahui jumlah abu yang terdapat pada suatu bahan terkait dengan mineral dari bahan yang dianalisis. Cawan abu porselen dibersihkan dan dikeringkan di dalam oven bersuhu sekitar 105 0 C selama 30 menit. Cawan abu porselen tersebut dimasukkan ke dalam desikator (30 menit) dan kemudian ditimbang. Sampel sebanyak 5 gram ditimbang dalam cawan porselen. Selanjutnya dibakar di atas kompor listrik sampai tidak berasap dan dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600 o C selama 7 jam. Cawan dimasukkan di dalam desikator dan dibiarkan sampai dingin dan kemudian ditimbang. Keterangan : % Kadar abu = C - A x 100% B - A A = Berat cawan abu porselen kosong (gram) B = Berat cawan abu porselen dengan sampel (gram) C = Berat cawan abu porselen + sampel setelah dikeringkan (gram) c) Analisis kadar protein (AOAC 2005) Analisis protein, yaitu untuk mengetahui kandungan dari protein kasar (crude protein) pada suatu bahan. Tahapan yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. 1) Tahap destruksi Sampel ditimbang seberat 1 gram. Kemudian sampel dimasukkan ke dalam labu kjeldahl. Setengah butir katalis selenium dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan ditambahkan 10 ml H 2 SO 4. Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 410 o C ditambah 10 ml air. Proses destruksi dilakukan sampai larutan menjadi jernih.
22 2) Tahap destilasi Larutan yang telah jernih didinginkan kemudian ditambah 50 ml akuades dan 20 ml NaOH 40 %, lalu didestilasi. Hasil destilasi ditampung dalam erlenmeyer 125 ml yang berisi 25 ml asam borat (H 3 BO 3 ) 2 % yang mengandung indikator bromcherosol green 0,1 % dan methyl red 0,1% dengan perbandingan 2:1. Destilasi dilakukan dengan menambahkan 50 ml larutan NaOH-Na 2 S 2 O 3 ke dalam alat destilasi hingga tertampung 40 ml destilat di dalam erlenmeyer dengan hasil destilat berwarna hijau kebiruan. 3) Tahap titrasi Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,09 N sampai warna larutan pada erlenmeyer berubah warna menjadi merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat. Perhitungan kadar protein api-api adalah sebagai berikut: % Nitrogen = (ml HCl sampel ml HCl blanko) x N HCl x 14 x 100% mg berat awal % Kadar Protein = % nitrogen x faktor konversi (6,25) d) Analisis kadar lemak (AOAC 2005) Sampel seberat 5 gram (W 1 ) dimasukkan ke dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W 2 ) dan disambungkan dengan tabung soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak. Tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi soxhlet lalu dipanaskan pada suhu 40 0 C dengan menggunakan pemanas listrik selama 16 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 0 C, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan (W 3 ).
23 Kadar lemak ditentukan dengan rumus sebagai beikut. % Kadar lemak = W 3 - W 2 x100% W 1 Keterangan : W 1 = Berat sampel (gram) W 2 = Berat labu lemak tanpa lemak (gram) W 3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram) 3.3.3 Ekstraksi dari tumbuhan api-api (Avicennia marina (Forks.)Vierh.) Tahap ekstraksi dilakukan secara tunggal dengan teknik maserasi menggunakan pelarut metanol pro analisis. Sampel tumbuhan api-api ditimbang sebanyak 25 gram masing-masing untuk daun dan kulit batang dari hasil pengeringan dan dimasukkan dalam erlenmeyer. Pelarut metanol ditambahkan sampai sampel terendam dengan perbandingan bahan dan pelarut adalah 1:3 (b/v), lalu Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan alumunium foil. Sampel dimaserasi menggunakan orbital shaker selama 24 jam. Setelah 24 jam, larutan ekstrak yang diperoleh disaring dengan kertas saring Whatman 42 untuk memisahkan filtrat dan residu yang dihasilkan. Maserasi dilakukan berulang sebanyak 16 kali. Hasil penggabungan filtrat yang didapat dievaporasi pada suhu 37 o C. Filtrat yang diperoleh hasil evaporasi disimpan dalam botol ekstrak untuk dianalisis, yaitu uji fitokimia kualitatif, uji kadar flavonoid total dan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH. Sebelum dilakukan pengujian aktivitas antioksidan ekstrak kasar yang diperoleh dilakukan perhitungan untuk nilai rendemen hasil ekstrakan. 3.3.4 Uji komponen fitokimia (Harborne 1987) Uji fitokimia dilakukan untuk menentukan komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak kasar pohon api-api untuk masing-masing perlakuan. Uji fitokimia yang dilakukan terdiri dari uji alkaloid, steroid/triterpenoid, flavonoid, saponin, fenol hidrokuinon, dan tanin. Metode uji ini berdasarkan Harborne (1987). a) Uji alkaloid Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid yaitu, pereaksi Dragendorff, pereaksi
24 Meyer, dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, endapan coklat dengan pereaksi Wagner dan endapan merah hingga jingga dengan pereaksi Dragendorff. b) Uji steroid/triterpenoid Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform 99,98 % dalam tabung reaksi. Asetat pekat diencerkan menggunakan air dan alkohol ditambahkan sebanyak 10 tetes kemudian ditambahkan asam sulfat pekat 3 tetes ke dalam campuran tersebut. Hasil uji positif mengandung steroid dan triterpenoid yaitu dengan terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau. c) Uji flavonoid Sejumlah sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37 % dan etanol 95 % dengan volume yang sama) dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Hasil uji positif sampel mengandung flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol. d) Uji fenol hidrokuinon (pereaksi FeCl 3 ) Sejumlah sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70 %. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambah 2 tetes larutan FeCl 3 5 %. Hasil uji positif sampel mengandung fenol hidrokuinon ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau atau hijau biru. e) Tanin Sejumlah sampel ditambahkan FeCl 3 kemudian campuran dihomogenkan. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah pada campuran. f) Uji Saponin Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan adanya saponin.
25 3.3.5 Uji kadar flavonoid total Sebanyak 0,5 ml ekstrak yang telah diencerkan dengan etanol p.a (1:10 g/ml) ditambah 1,5 ml etanol p.a; 0,1 ml AlCl 3 10 %; 0,1 ml natrium asetat 1 M; dan 2,8 ml akuades. Campuran larutan tersebut dibiarkan selama 30 menit dan diukur absorbansinya pada 417 nm. Kuersetin digunakan untuk membuat kurva kalibrasi. Kandungan total flavonoid dalam ekstrak etanol diekspresikan sebagai mg kuersetin/gram serbuk kering. 3.3.6 Uji aktivitas antioksidan Uji aktivitas antioksidan yang dilakukan menggunakan metode DPPH berdasarkan kemampuan sampel yang digunakan dalam mereduksi radikal bebas stabil l,l-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Blanko dibuat dari larutan methanol dengan konsentrasi 200, 400, 600, dan 800 ppm. Sebanyak 0,01 mg ekstrak apiapi dibutuhkan untuk membuat larutan stok dengan konsentrasi 200, 400, 600, dan 800 ppm. Sebanyak 0,0004 mg butylated hydroxytoluena (BHT) sebagai standar ditimbang lalu ditambah 50 ml metanol dengan konsentrasi 2, 4, 6, dan 8 ppm. Selanjutnya 0,0098 mg DPPH diencerkan dengan 25 ml metanol. Selanjutnya pemberian DPPH pada larutan stok dan BHT untuk masing-masing konsentrasi. Campuran dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 30 menit. Serapan yang dihasilkan diukur dengan spektrofotometer UV-Visible pada panjang gelombang 517 nm. Persentase penghambatan aktivitas radikal bebas diperoleh dari nilai absorbansi sampel. Persamaan regresi diperoleh dari hubungan antara konsentrasi sampel dan presentase penghambatan aktivitas radikal bebas. Aktivitas antioksidan dari masing-masing sampel dan antioksidan pembanding BHT dinyatakan dengan persen inhibisi, yang dihitung dengan formulasi sebagai berikut: absorbansi blanko absorbansi sampel % inhibisi = x 100 % absorbansi blanko Nilai konsentrasi penghambatan aktivitas radikal bebas sebanyak 50 % (IC 50 ) dihitung dengan menggunakan persamaan regresi linier. Nilai IC 50
26 diperoleh dengan memasukkan y=50 serta nilai A dan B yang telah diketahui. Nilai x sebagai IC 50 dapat dihitung dengan persamaan : y = A + B Ln (x) Y = persen inhibisi X = konsentrasi sampel (ppm) A = slope, B = intercept