BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian dasar dengan metode eksperimen (Nazir, 1983). B. Desain Penelitian Penelitian ini menggunakan desain Rancangan Acak Lengkap (RAL), karena penelitian dilakukan di laboratorium dengan kondisi yang relatif homogen. Penelitian dilakukan pada bakteri penyebab infeksi pada kulit, yaitu P. aeruginosa dengan menggunakan ekstrak A. conyzoides tipe liar yang berada di sekitar Universitas Pendidikan Indonesia dan ditanam kembali di Kebun Botani Universitas Pendidikan Indonesia. Bagian tumbuhan A. conyzoides yang digunakan dalam penelitian yaitu bagian daun dan akar. Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan Soxhlet. Ekstraksi menggunakan pelarut metanol. Pembuatan kurva tumbuh bakteri P. aeruginosa dilakukan sebelum uji aktivitas antibakteri. Penelitian dilakukan dengan menggunakan metode disc-diffusion untuk uji aktivitas (Cappuccino&Sherman, 1987) dan macro-dillution untuk nilai MIC (Minimum Inhibitory Concentration) (NCCLS, 2003) dan MBC (Minimum Bactericidal Concentration) (Agoramoorthy et al., 2007, Akinyemi et al., 2005). 20
21 Konsentrasi yang digunakan untuk uji disc-diffusion antara ekstrak methanol daun dan akar A. conyzoides berbeda. Konsentrasi methanol daun dan akar yang digunakan sebagai uji pendahuluan adalah 10 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 250 mg/ml, 500 mg/ml, dan 750 mg/ml (Okwori et al., 2007). Berdasarkan uji pendahuluan, konsentrasi daun dan akar yang digunakan untuk disc-diffusion dapat dilihat pada Tabel 3.1. Tabel 3.1 Konsentrasi Daun dan Akar pada Uji Disc-diffusion Agen Konsentrasi Daun Akar 500 mg/ml 600 mg/ml 700 mg/ml 800 mg/ml 900 mg/ml 10 mg/ml 100 mg/ml 200 mg/ml 300 mg/ml 400 mg/ml 500 mg/ml. Pada pengujian disc-diffusion dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali (de Oliveira et al., 2007), dengan kontrol negatif DMSO 1% (Niewiadomy et al., 2005) dan kontrol positif antibiotik tetracycline 5 mg/ml (Mahato&Chaudhary, 2005). Parameter yang diukur dalam penelitian ini adalah diameter zona hambat, nilai MIC, dan nilai MBC dari setiap ekstrak bagian tumbuhan. Data diameter zona hambat dari masing-masing konsentrasi ekstrak methanol daun dan akar A. conyzoides kemudian diolah dengan menggunakan SPSS 10 for windows.
22 C. Populasi dan Sampel Populasi dalam penelitian ini adalah tumbuhan A. conyzoides L. tipe liar sedangkan untuk sampel adalah tumbuhan A. conyzoides L. tipe liar yang berada di Kebun Botani Biologi Universitas Pendidikan Indonesia. D. Tempat Penelitian Penelitian ini dimulai bulan Februari 2009 sampai Juli 2009 yang dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Fisiologi Universitas Pendidikan Indonesia, Jalan Dr. Setiabudi No. 229 Bandung. E. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah seperti yang tercantum dalam Tabel 3.2. Tabel 3.2 Daftar Alat-Alat Penelitian No. Alat-Alat Laboratorium Spesifikasi Jumlah 1. Autoclave HL36AE 1 buah 2. Botol semprot - 1 buah 3. Batang pengaduk kaca - 1 buah 4. Cawan Petri Noermax 12x100 mm 25 buah 5. Corong - 1 buah 6. Colony counter SIBATA 1 buah 7. Jangka sorong Caliper 1 buah 8. Inkubator Gallenkamp 1 buah 9. Jarum Inokulasi - 2 buah
23 No. Alat-Alat Laboratorium Spesifikasi Jumlah 10. Gelas ukur Pyrex 100 ml 1 buah 11. Kertas saring Whatman no.1 3 lembar 12. Soxhlet - 1 buah 13. Laminar air flow - 1 buah 14. Mikro pipet 100-1000 µl ; 20-200 µl @1 buah SOCOREX CALIBRA 822 15. Lampu spirtus - 1 buah 16. Jangka sorong Caliper 1 buah 17. Pinset - 2 buah 18. Makro pipet 5 ml; 10 ml SIBATA @ 1 buah 19. Becker glass Pyrex @ 2 buah 20. Rak tabung - 1 buah 21. Hot Plate RCH-3 1 buah 22. Spatula - 2 buah 23. Timbangan analitik HF-300 1 buah 24. Tabung reaksi Pyrex 13x150 mm 50 tabung 25. Waterbath shaker EYELA NTS-1300 1 buah 26. Kertas cakram Steril 200 keping 27. Destilator - 1 buah 28. Spectrophotometer MILTON ROY 1 buah spectronic 20D 29. Labu erlenmeyer 250ml; 500 ml @1 buah Pyrex 30. Cuvette Pyrex 2 buah 31. Botol kaca gelap 250 ml 10 buah 32. Tabung effendorf 1.5 ml 40 buah 33. Vortex mixer SIBATA TTM-1 1 buah 34. ph meter UCHIDA KT-1A 1 buah 35. Tabung screw-cap - 5 buah
24 Adapun bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian adalah seperti yang tercantum dalam Tabel 3.3. Tabel 3.3 Daftar Bahan-Bahan Penelitian No. Bahan-Bahan Kimia Spesifikasi Jumlah 1. Daun dan akar babadotan - - (Ageratum conyzoides) 2. Biakan bakteri ATCC 15442 1 tabung Pseudomonas aeruginosa 3. Aquades - 10 liter 4. Methanol Pro Analyst 2 liter 5. DMSO 1% - 100 ml 6. Tetracycline Kimia Farma 5 mg/ml 7. Spirtus - 1 liter 8. NaCl Teknis 35 gram 9. BaCl 2 Pro analyst, Merck 1.175 gram 10. H 2 SO 4 Pro analyst, Merck 1 ml 11. Alkohol 70% - 2 liter 12. Beef Extract - 8 gram 13. Pepton Oxoid 10 gram F. Langkah Kerja Penelitian ini dibagi menjadi tiga tahap yaitu tahap persiapan, tahap pelaksanaan dan tahap perlakuan. 1. Tahap Persiapan Tahap persiapan ini meliputi pengumpulan alat dan bahan yang akan digunakan dalam penelitian. Bagian tumbuhan A. conyzoides yang akan digunakan adalah daun
25 dan akar. Sebelumnya dilakukan identifikasi terhadap tumbuhan dengan menggunakan kunci determinasi Flora of Java (Backer&Brink, 1965). 2. Tahap Pelaksanaan a. Ekstraksi Tumbuhan A. conyzoides bagian daun dan akar dipisahkan, lalu dikeringkan dalam suhu ruang hingga kering. Setelah tumbuhan kering, tumbuhan dihaluskan hingga berbentuk serbuk (simplisia). Simplisia sebanyak 10 gram dibungkus dengan kertas saring, lalu dimasukkan ke dalam Soxhlet yang sebelumnya diisi dengan 100 ml metanol. Lalu soxhlet dipanaskan di atas penangas air hingga mencapai suhu 64,7 0 C (suhu didih metanol). Proses ekstraksi ini dilakukan selama enam jam. Setelah enam jam, pelarut diuapkan hingga pelarut habis dengan menggunakan destilator. Setelah pelarut habis, hasil ekstraksi ditimbang lalu disimpan ke dalam botol dengan kemasan yang baik dan disimpan di dalam lemari es (Fitriani, 1988). A A A B Gambar 3.1 A. Serbuk Daun A. conyzoides; B. Serbuk Akar A. conyzoides (Sumber : Koleksi Pribadi)
26 b. Sterilisasi Bahan, media dan alat tahan panas yang digunakan disterilkan dengan autoclave menggunakan uap air jenuh bertekanan satu atm pada suhu 121 0 C selama 15 menit. Alat yang tidak tahan panas disterilkan dengan cara dibilas alkohol 70%. c. Pembuatan Kurva Tumbuh Bakteri Pseudomonas aeruginosa Bakteri uji diaktivasi terlebih dahulu dengan menginokulasikan satu ose bakteri yang diambil dari biakan murni, ke dalam labu Erlenmeyer yang berisi 10 ml medium NB (Nutrient Broth) lalu di inkubasi pada Waterbath Shaker dengan kecepatan 120 rpm dengan suhu 37 0 C selama 24 jam. Setelah 24 jam, biakan bakteri yang telah diaktivasi tadi kemudian ditambahkan ke dalam labu Erlenmeyer yang berisi 90 ml medium Nutrient Broth lalu diinkubasi lagi dengan kecepatan 120 rpm dengan suhu 37 0 C selama 24 jam. Labu ini adalah kultur inokulum. Metode yang digunakan untuk membuat kurva tumbuh ini dinamakan Metode Turbidimetri, karena yang diukur adalah nilai absorbansi kultur menggunakan spectrophotometer. Setiap interval dua jam selama 24 jam, dari labu kultur diambil lima ml lalu dimasukkan ke dalam cuvette. Kemudian nilai absorbansi dihitung dengan spectrophotometer dengan panjang gelombang 600 nm. Kurva tumbuh dibuat berdasarkan hasil hubungan nilai absorbansi (sumbu Y) dengan waktu (sumbu X). Dari kurva tumbuh ini dapat diketahui umur biakan pada saat mencapai fase log. Pada fase log inilah ditentukan laju pertumbuhan dan waktu generasi P. aeruginosa sehingga umur inokulum untuk uji aktivitas dapat ditentukan (Cappuccino&Sherman, 1987).
27 d. Pembuatan Kurva Baku Bakteri Pseudomonas aeruginosa Aktivasi bakteri menggunakan medium Nutrient Broth sebanyak 10 ml yang sebelumnya dimasukkan biakan bakteri sebanyak satu ose. Lalu kultur diinkubasi pada Waterbath Shaker dengan kecepatan 120 rpm dengan suhu 37 0 C selama 24 jam. Setelah 24 jam, biakan bakteri yang telah diaktivasi tadi kemudian ditambahkan ke dalam labu Erlenmeyer lain yang berisi 90 ml medium Nutrient Broth lalu diinkubasi lagi dengan kecepatan 120 rpm dengan suhu 37 0 C selama waktu yang dibutuhkan untuk mencapai fase logaritmik. Berdasarkan hasil pembuatan kurva tumbuh, bakteri mencapai fase log pada jam ke-2 sampai jam ke-8. Waktu pencuplikan ditentukan berdasarkan kurva tumbuh yaitu pada jam ke-4, 6 dan 8. Setelah itu, diambil sebanyak lima ml inokulum kemudian dimasukkan ke dalam cuvette untuk dihitung nilai absorbansi. Bersamaan dengan itu, diambil satu ml biakan ke dalam tabung reaksi yang berisi sembilan ml aquades steril untuk pengenceran 10-1 lalu dihomogenkan dengan vortex. Dari tabung pengenceran 10-1 kemudian diambil lagi sebanyak satu ml dan dimasukkan ke dalam sembilan ml aquades steril lain untuk pengenceran 10-2, begitu seterusnya hingga pengenceran 10-8. Pada pengenceran 10-8, 10-7 dan 10-6 diambil satu ml biakan, lalu dimasukkan ke dalam cawan petri steril kemudian dicampurkan dengan sembilan ml medium Nutrient Agar. Biakan diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam. Jumlah koloni bakteri uji yang tumbuh dihitung dengan menggunakan colony counter sehingga didapat waktu terbaik untuk dijadikan inokulum (Cappuccino&Sherman, 1987).
28 e. Pembuatan Larutan Stok Ekstrak Ekstrak hasil ekstraksi dibuat stok 1000 mg/ml. Ekstrak tersebut ditimbang hingga mendapatkan berat 1000 mg lalu dilarutkan ke dalam satu ml DMSO 1%. Penggunaan selanjutnya diencerkan kembali dengan pelarut DMSO 1% sehingga mendapatkan konsentrasi yang diinginkan. Hal yang sama dilakukan untuk ekstrak methanol daun dan akar A. conyzoides. f. Pembuatan Standar Turbiditas Inokulum Nilai densitas standar inokulum equivalen dengan 0,5 McFarland standard. Pembuatan larutan standar, menggunakan larutan BaCl 2 yang kemudian ditambahkan ke dalam H 2 SO 4. Campuran yang akan digunakan sebelumnya diaduk secara konstan untuk mempertahankan suspensi. Densitas yang tepat untuk standar turbiditas ini dihitung dengan menggunakan spectrophotometer. Absorbansi dihitung pada panjang gelombang 625 nm sehingga menghasilkan standar 0,5 McFarland. Setelah nilai absorbansi sesuai, larutan yang telah dibuat di simpan dalam tabung screw-cap dan dilapisi dengan aluminium foil. Tabung ditutup rapat dan disimpan dalam suhu kamar. Larutan standar harus dikocok menggunakan vortex sebelum digunakan. Apabila terdapat partikel besar larutan harus diganti (NCCLS, 2003). g. Persiapan Inokulum Standar inokulum yang digunakan dibuat dengan menumbuhkan mikroorganisme hingga mencapai fase log sehingga turbiditasnya sesuai dengan 0,5 McFarland
29 standard. Satu ml biakan bakteri ditambahkan dengan larutan fisiologis (NaCl 0.85%) hingga kekeruhannya sama dengan 0.5 Mc Farland standard (Mulu et al., 2004). 3. Tahap Perlakuan a. Disc-diffusion Uji antimikroba dengan metode disc-diffusion, digunakan medium Nutrient Agar dengan teknik Spread Plate. Medium Nutrient Agar dipanaskan hingga mencair, lalu sebanyak sembilan ml ditempatkan ke dalam cawan petri. Biakan bakteri disesuaikan kekeruhannya dengan 0,5 McFarland Standard. Lalu sebanyak 0.2 ml inokulum bakteri dimasukkan ke dalam cawan petri lalu diratakan dengan tongkat L steril, lalu dibiarkan meresap. Cakram steril direndam selama dua menit pada ekstrak dan setiap cakram ditempatkan dengan menggunakan pinset steril. Cakram ditekan dengan menggunakan tongkat L steril untuk memastikan cakram menempel pada medium. Untuk konsentrasi kontrol positif, menggunakan antibiotik tetracycline 5 mg/ml sedangkan konsentrasi kontrol negatif dengan menggunakan DMSO 1% dilakukan dengan cara yang sama. Satu cawan petri terdiri dari tiga cakram kertas dengan konsentrasi ekstrak yang berbeda dan dua cakram kertas masing-masing dengan konsentrasi kontrol positif dan kontrol negatif. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam dan diukur zona penghambatan berdasarkan diameter area bening di sekitar cakram kertas dengan menggunakan jangka sorong (Cappuccino&Sherman, 1987).
30 b. MIC (Minimum Inhibitory Concentration) Uji aktivitas untuk menentukan nilai MIC ini menggunakan medium Nutrient Broth. Tabung reaksi steril disiapkan, lalu sebanyak empat ml medium Nutrient Broth dimasukkan ke dalam tabung. Setelah itu, 100 µl larutan ekstrak ditambahkan ke dalam tabung, lalu sebanyak 900 µl inokulum dimasukkan ke dalam tabung tadi. Inokulum yang digunakan kekeruhannya sama setelah dibandingkan dengan 0.5 Mc Farland standard. Biakan bakteri diambil sebanyak satu ml kemudian dilakukan pengenceran menggunakan larutan NaCL 0.85% (0.85 gram dalam 100 ml aquades steril). Kemudian biakan dalam larutan tersebut dibandingkan dengan larutan 0.5 Mc Farland standard sampai kekeruhannya sama. Untuk tabung kontrol negatif dengan DMSO 1% dan tabung kontrol positif dengan antibiotik tetracycline 5 mg/ml dilakukan dengan cara yang sama. Setiap tabung ditutup dengan penutup kapas. Setelah penambahan inokulum tabung diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam. Setelah itu diamati pertumbuhan dan nilai MICnya. Penentuan nilai MIC ditentukan dengan cara membandingkan semua konsentrasi dan diamati secara kasat mata (NCCLS, 2003). Nilai MIC ditunjukkan dengan konsentrasi ekstrak terkecil yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri secara visual. Konsentrasi yang digunakan dalam uji MIC adalah hasil screening terlebih dahulu dari konsentrasi yang digunakan dalam uji aktivitas dengan metode disc-diffusion. Konsentrasi yang dicantumkan adalah konsentrasi akhir setelah dihitung dengan volume total yaitu volume medium cair, volume inokulum bakteri dan volume ekstrak yang ditambahkan pada tabung kultur.
31 c. MBC (Minimum Bactericidal Concentration) Uji aktivitas untuk nilai MBC menggunakan medium Nutrient Agar dengan teknik Spread Plate. Cawan petri steril disiapkan, lalu sebanyak 100 µl dari setiap tabung uji MIC dimasukkan ke dalam cawan petri yang berisi medium Nutrient Agar yang telah disiapkan (Agoramoorthy et al, 2007). Kemudian diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam. Setelah itu diamati dan dihitung jumlah koloni yang tumbuh. Penentuan nilai MBC ditentukan pada konsentrasi ekstrak terendah tidak ada koloni bakteri yang tumbuh pada medium padat atau satu koloni yang tumbuh (Akinyemi et al., 2005). G. Uji Statistika Uji statistika yang digunakan untuk mengetahui pengaruh ekstrak akar dan daun A. conyzoides L. terhadap pertumbuhan P. aeruginosa yaitu dengan menggunakan program SPSS versi 10.0 for window dengan tingkat kepercayaan 95%. Menguji distribusi data dengan uji Normalitas, dilanjutkan dengan menguji variansi data diameter zona hambat dengan uji Homogenitas. Uji Normalitas dan uji Homogenitas dilakukan pada data masing-masing jenis ekstrak. Kemudian dilakukan uji Kruskall- Wallis untuk mengetahui ada tidaknya pengaruh pemberian ekstrak methanol daun dan akar A. conyzoides terhadap pertumbuhan bakteri P. aeruginosa.
32