39 IV. BAHAN DAN METODE PENELITIAN 4.1. Waktu dan Tempat Percobaan Percobaan pendahuluan dilakukan pada bulan Mei sampai September 2011, sedangkan percobaan utama dilakukan pada bulan Desember 2011 sampai Januari 2012. Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Pangan, Laboratorium Keteknikan Pengolahan Pangan, Laboratorium Pengujian, Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Laboratorium Pilot Plan Jurusan Teknologi Industri Pangan, Fakultas Teknologi Industri Pertanian, Universitas Padjadjaran dan Laboratorium Kimia Organik Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran. 4.2. Bahan dan Alat Percobaan Bahan baku yang digunakan adalah tanaman daun singkong (Manihot utilissima), bayam cabut (Amaranthus spp.), kangkung darat (Ipomea reptans Poir.), dan daun pepaya (Carica papaya Linn.). Daun tanaman sayur diperoleh dari pasar, merupakan daun sayuran yang umum dikonsumsi masyarakat. Selanjutnya dipilih daun urutan 3, 4, dan 5 secara acak. Bahan baku pembantu yang digunakan antara lain etanol teknis 96%, natrium bikarbonat, aquades, dekstrin, dan aseton 85%. Alat yang digunakan adalah grinder, gelas kimia, gelas ukur, batang pengaduk, corong, kertas saring, aluminium foil, plastik wrap (cling wrap), loyang kaca, spatula, pipet tetes, pipet ukur, tabung reaksi, tabung vial, timbangan teknis, timbangan analitis, rotary vacum evaporator, spektrofotometer Spektronik-21, dan kromameter CR-400. FTIP001628/039
40 4.3. Metode Penelitian Metode penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan pola faktorial. Rancangan percobaan ini digunakan karena adanya keterbatasan alat dan mempermudah pengerjaan karena adanya pengelompokkan perlakuan. Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan pola faktorial ini terdiri dari 2 faktor. Faktor pertama dan kedua masing-masing terdiri dari 3 taraf dan diulang sebanyak 3 kali. Faktor pertama (A) adalah jenis komoditas sayuran yang akan diekstraksi klorofilnya, yaitu: a1 = daun singkong a2 = daun bayam a3 = daun pepaya Faktor kedua (B) adalah lama pemanasan oven vakum pada suhu 40ºC, yaitu: b1 = 30 menit b2 = 60 menit b3 = 90 menit Dengan demikian terdapat 9 kombinasi perlakuan yang diperoleh, yaitu: a1b1 a2b1 a3b1 a1b2 a2b2 a3b2 a2b3 a3b3 FTIP001628/040
41 Tabel 5. Tata Letak Percobaan Perlakuan 1 2 3 4 5 6 7 8 9 I a1b2 a3b1 a2b2 a1b1 a3b3 a2b1 a2b3 a3b2 Ulangan II a3b1 a2b2 a1b1 a3b3 a2b1 a2b3 a3b2 III a3b3 a2b1 a2b3 a3b2 a3b1 a2b2 a1b1 Model linier dalam rancangan percobaan ini adalah: Yijk = µ + Ri + Aj + Bk + (AB)jk + Eijk Yijk = Respon yang diamati pada ulangan ke-1, perlakuan A taraf ke-j dan perlakuan B taraf ke-k µ = Rata-rata umum Ri = Pengaruh ulangan taraf ke-i Aj = Pengaruh faktor ke-a taraf ke-j Bk = Pengaruh faktor ke-b taraf ke-k (AB) jk = Pengaruh interaksi faktor A taraf ke-j dan faktor B taraf ke-k Eijk = Pengaruh kesalahan percobaan pada ulangan ke-k karena pengaruh Aj, Bk, (AB) jk FTIP001628/041
42 Tabel 6. Tabel Sidik Ragam Sumber Ragam DB Ulangan 2 Perlakuan (8) Jenis komoditas (A) Suhu pengeringan (B) JK KT 2,59 3,63 2 3,63 Interaksi (AB) 4 JKP JKA JKB Galat 16 JKT JKU JKP Total 26 F0,05 3,63 2 Fhit 3,01 Sumber: Gasperz (1994) Adanya pengaruh setiap perlakuan diketahui dengan menggunakan uji F pada taraf 5% dan perbedaan antar perlakuan diuji dengan menggunakan Uji Jarak Berganda Duncan pada taraf nyata 5% (LSR Test) dengan rumus sebagai berikut: LSR = Nilai 1. x SSR dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: untuk menguji faktor jenis komoditas penghasil klorofil (A) LSR = 2. untuk (A) x SSR 5% menguji faktor suhu yang digunakan dalam pengeringan menggunakan oven vakum (B) FTIP001628/042
43 LSR = 3. (B) x SSR 5% untuk menguji interaksi (AB) LSR = x SSR 5% dimana: r = banyaknya ulangan a = banyaknya taraf perlakuan A b = banyaknya taraf perlakuan B 4.4. Pelaksanaan Percobaan 4.4.1. Percobaan Pendahuluan Percobaan pendahuluan yang dilakukan adalah pembuatan ekstrak pigmen yang mengacu pada hasil penelitian Wulandari (2011). Percobaan pendahuluan dilakukan untuk menentukan tiga komoditas penghasil klorofil terbaik dilihat dari: 1. Pengamatan intensitas warna secara subjektif dan diukur nilai a* (Hutching, 1999). 2. Perhitungan total klorofil, klorofil a, dan klorofil b (AOAC, 1970). 3. Perhitungan rendemen klorofil terenkapsulasi. FTIP001628/043
44 4.4.2. Percobaan Utama Percobaan utama yang dilakukan yaitu ekstraksi pigmen klorofil berdasarkan metode Wulandari (2011). Tahapan-tahapan yang dilakukan pada percobaan utama: 1. Penyiapan sampel (daun singkong, bayam, dan daun pepaya) a) Sortasi sampel Sortasi bertujuan untuk memilih sampel yang tidak cacat, warnanya seragam, dan tidak robek. Daun yang dipilih merupakan daun yang kematangannya cukup dengan umur panen ± 3 bulan. b) Pencucian sampel Proses pencucian bertujuan untuk mendapatkan daun yang bersih, yaitu bebas dari kotoran, kerikil, dll. Pencucian sebanyak tiga kali dilakukan dengan perendaman di bawah air mengalir, lalu tiap helai daun dipindahkan ke baskom air yang lain yang bertujuan agar tidak ada kotoran yang tertinggal yang dapat mengganggu hasil akhir. c) Pengecilan ukuran Pengecilan ukuran dilakukan dengan menghancurkan jaringan daun menggunakan grinder hingga semua daun halus sempurna. 2. Ekstraksi Pigmen Klorofil a) Pembuatan ekstrak Hancuran daun diekstraksi menggunakan pelarut etanol 96% yang telah ditambahkan Na-bikarbonat 1000 ppm selama 12 jam. Komposisi bahan dan pelarut adalah 1:4. FTIP001628/044
45 b) Pemekatan ekstrak Pemekatan ekstrak dilakukan menggunakan rotavapor sampai pekat 2%. 3. Mikroenkapsulasi Klorofil a) Penyalutan ekstrak klorofil dengan dekstrin Ekstrak pigmen klorofil selanjutnya disalut dengan penggunaan dekstrin pada konsentrasi 50% (b/v) lalu ditambahkan aquades dengan perbandingan 1:7,5 b) Pengeringan dengan oven vakum Pengeringan dilakukan dengan menggunakan oven vakum 40ºC pada 3 kondisi lama pengeringan yaitu 30, 60, dan 90 menit dengan jumlah ekstrak yang sama setiap perlakuan ± 5 ml. 4. Analisis a) Pengukuran total klorofil, klorofil a, dan klorofil b (AOAC, 1970) b) Pengamatan intensitas warna secara objektif dan diukur nilai a* (Hutching, 1999). Diagram proses pembuatan ekstrak pigmen klorofil disajikan pada Gambar 7 sedangkan diagram proses pembuatan klorofil terenkapsulasi dapat dilihat pada Gambar 8. FTIP001628/045
46 Daun Larutan Pengekstrak 400 ml: etanol Na.bikarbonat 1000 ppm Pencucian Perbandingan berat daun kangkung dan volume lar.pengekstrak 1: 4 Penirisan Penghancuran dengan grinder Ekstraksi dengan metode maserasi selama 12 jam pada suhu kamar Pemisahan ampas dengan penyaring vakum Residu Filtrat Pemisahan pelarut dengan rotavapor Etanol Ekstrak pekat klorofil Gambar 7. Diagram Proses Ekstraksi Pigmen Klorofil dari Daun Kangkung (Wulandari, 2011) FTIP001628/046
47 Ekstrak pekat pigmen klorofil 2% Dekstrin 50% dari ekstrak pekat Pencampuran Akuades (padatan:akuades = 1:7,5) Padatan = penyalut + ekstrak pigmen 5 ml campuran Pengeringan dengan oven vakum P abs = 20 25 in.hg; T = 40±5ºC t =90 menit t = 60 menit Bubuk klorofil terenkapsulasi Gambar 8. Diagram Proses Pembuatan Klorofil Terenkapsulasi (Wulandari, 2011) FTIP001628/047 t = 30 menit
48 4.5. Kriteria Pengamatan Kriteria pengamatan yang dilakukan, yaitu: 1. Kandungan total klorofil (klorofil a dan klorofil b) pada saat berbentuk ekstrak dan setelah menjadi bubuk terenkapsulasi diukur dengan metode spektrofotometri (AOAC, 1970) 2. Intensitas warna hijau (-a*) dari bubuk klorofil terenkapsulasi diukur menggunakan kromameter CR-400 (Hutching, 1999) 3. Rendemen bubuk pigmen klorofil terenkapsulasi (AOAC, 1970) FTIP001628/048