BAB IV Hasil dan Pembahasan Pada bab ini ditampilkan hasil dan pembahasan dari penyusunan basis data variasi nukleotida mtdna manusia serta sejumlah analisa variasi nukleotida pada mtdna manusia berdasarkan basis data yang telah disusun. IV.1 Penyusunan Basis Data Variasi Nukleotida mtdna Manusia Bagian ini terdiri dari hasil pengumpulan data dari basis data GenBank, pemisahan data, penentuan variasi nukleotida menggunakan program H-Man, penyusunan basis data variasi nukleotida, pembuatan matriks variasi nukleotida, dan penjajaran sampel mtdna pada tiap posisi variasi nukleotida yang ditemukan terhadap CRS. IV.1.1 Penyiapan Data mtdna Manusia Setelah dilakukan pencarian informasi complete genome mtdna manusia pada situs GenBank, ternyata sampai dengan bulan Juni 2007 terdapat sebanyak 2803 data mtdna manusia. Seluruh data mtdna dari GenBank tersebut kemudian disimpan dalam 29 file teks yang masing-masing terdiri dari 100 data mtdna manusia. File dalam format teks ini kemudian dipisahkan menjadi data mtdna tunggal untuk masing-masing individu dengan menggunakan program EditSeq DNASTAR. Proses pemisahan dan penamaan ulang ditunjukkan pada Gambar IV.1. Setiap data mtdna manusia pada basis data GenBank disertai dengan informasi mengenai penamaan kode akses sampel, jumlah pasang basa, nama penulis serta judul publikasi yang melaporkan urutan lengkap nukleotida sampel mtdna tersebut.
14 Gambar IV.1 Pemisahan dan penamaan ulang sampel Data dipisah menggunakan program EditSeq (DNASTAR) dan tiap sampel dilakukan penamaan ulang sesuai dengan kode akses di basis data GenBank. Setelah data terpisah menjadi 2803 file dengan format.seq (sequence) hasil pemotongan menggunakan program EditSeq, kemudian dilakukan penamaan ulang tiap sampel sesuai dengan kode akses pada basis data GenBank seperti yang ditunjukkan pada Gambar IV.1. Ternyata dari keseluruhan 2803 data mtdna manusia yang dikumpulkan dari basis data GenBank, hanya 2339 data yang menampilkan informasi panjang nukleotida sekitar 16,5 kb (panjang urutan lengkap mtdna manusia). Pada Kurva IV.1 ditampilkan informasi sebaran jumlah panjang pasang basa 2339 data mtdna manusia. Populasi sampel terbanyak adalah kelompok dengan panjang 16569 pasang basa, yaitu panjang basa yang sama dengan urutan standar mtdna manusia yang pertama kali ditemukan Anderson pada tahun 1981. Oleh karena itu, untuk selanjutnya pada penelitian ini dilakukan analisa terhadap 2339 data urutan lengkap complete genome mtdna manusia.
15 Jumlah sampel mtdna manusia Panjang pasang basa nukleotida sampel mtdna Kurva IV.1 Kurva sebaran sampel berdasarkan jumlah pasang basa Data terbanyak adalah sampel mtdna dengan panjang pasang basa 15659, sama dengan panjang CRS. IV.1.2 Penentuan Variasi Nukleotida terhadap CRS Tahap selanjutnya adalah melakukan penentuan variasi nukleotida 2339 data tmtdna manusia terhadap urutan nukleotida mtdna standar, CRS, menggunakan program Human mtdna Analyzer (H-Man) versi 1.2. Kemudian selanjutnya digunakan program SeqMan DNASTAR untuk keperluan pembuktian kebenaran hasil analisa program H-Man versi 1.2,. Pada Gambar IV.2 diperlihatkan contoh analisa dengan program SeqMan, yaitu melakukan penjajaran urutan 16,5 kb nukleotida sampel mtdna terhadap CRS. Program Seqman tidak menampilkan informasi posisi variasi nukleotida sebagaimana pada hasil analisa program H-Man, melainkan menggunakan penandaan dengan tampilan huruf berwarna merah pada tiap posisi nukleotida yang berbeda dengan CRS. Hal ini menyebabkan pengamatan posisi variasi nukleotida sampel terhadap CRS menggunakan SeqMan tidak secepat hasil analisa program H-Man. Hasil perbandingan posisi mutasi kedua program tersebut pada sejumlah sampel menunjukkan H-Man versi 1.2 ternyata akurat untuk penentuan posisi mutasi jenis substitusi dan delesi, sedangkan untuk penentuan posisi insersi program ini masih perlu pengembangan lebih lanjut. Oleh karena itu, tiap posisi insersi baru
16 yang ditemukan hasil analisa H-Man selanjutnya dianalisa ulang sesuai dengan hasil penjajaran menggunakan program SeqMan. Gambar IV.2 Contoh hasil analisa program SeqMan (DNASTAR) Pada program ini ditunjukkan penjajaran tiap nukleotida sampel terhadap CRS. Perbedaan nukleotida ditunjukkan dengan tampilan huruf berwarna merah. Hasil analisa variasi nukleotida program H-Man versi 1.2 selanjutnya disimpan dalam format coma delimited (.csv) untuk memudahkan penyusunan ke dalam basis data menggunakan program Microsoft Excel. Tanda koma dalam format.csv akan dikenali sebagai kolom, sehingga data mutasi hasil analisa program H-Man akan terpisah dengan sendirinya dalam kolom yang berbeda ketika diproses dengan program Microsoft Excel 2003. IV.1.3 Penyusunan Basis Data Variasi Nukleotida Selanjutnya seluruh informasi variasi nukleotida tiap sampel digabungkan menjadi basis data variasi nukleotida masing-masing sampel mtdna manusia terhadap CRS. Proses pemindahan data variasi nukleotida (mutasi terhadap CRS)
17 dari format coma delimited ke dalam basis data dilakukan menggunakan program spreadsheet macro programs pada Microsoft Excel 2003. Gambar IV.3 Basis data variasi nukleotida mtdna manusia terhadap CRS Basis data ini menampilkan kumpulan sampel sesuai kode akses nya pada GenBank, jumlah basa, jumlah dan detail variasi nukleotida terhadap CRS. Data dibagi dalam 29 sheet yang masing-masing terdapat sekitar 100 data. Pada basis data variasi nukleotida complete genome mtdna manusia yang telah berhasil disusun seperti yang ditampilkan pada Gambar IV.3 di atas, dikumpulkan informasi variasi nukleotida dengan jumlah sampel 180 kali lebih banyak dibandingkan pembuatan basis data variasi nukleotida mtdna manusia pada tahun 1991. Basis data ini merupakan informasi baru sebagai pelengkap informasi genetik DNA mitokondria manusia yang dikumpulkan pada basis data MITOMAP. IV.1.4 Pembuatan Matriks Variasi Nukleotida mtdna Manusia Tahap berikutnya adalah pembuatan matriks untuk mengumpulkan posisi-posisi variasi nukleotida yang ditemukan pada masing-masing sampel. Matriks yang disusun ditunjukkan pada Gambar IV.4.
18 Gambar IV.4 Matriks posisi variasi nukleotida mtdna manusia terhadap CRS Kolom pertama menampilkan posisi-posisi mutasi terhadap CRS, baris satu dan dua pada matriks adalah posisi input sampel (terdiri dari informasi kode akses, jumlah basa, jumlah variasi nukleotida, posisi dan perubahan basanya). Sel A1 dan A2 berfungsi untuk mencocokkan jumlah variasi nukleotida sampel dengan jumlah variasi yang tercatat dalam matriks, sedangkan baris 3 berfungsi untuk menentukan posisi variasi nukleotida baru yang belum tercatat dalam matriks. Akhirnya setelah selesai dimasukkan 2339 sampel mtdna manusia ke dalam matriks, diperoleh total 3998 posisi variasi nukleotida terhadap CRS. Dengan kata lain telah ditemukan 1837 posisi variasi nukleotida baru pada matriks dibandingkan hasil penelitian sebelumnya oleh Yoni F. Syukriani pada tahun 2007. IV.1.5 Penjajaran Data Variasi Nukleotida terhadap CRS Setelah semua posisi variasi nukleotida mtdna diketahui, selanjutnya seluruh sampel mtdna manusia dijajarkan terhadap CRS. Setelah itu tiap sampel kemudian dikumpulkan sesuai panjang pasang basanya. Basis data penjajaran data variasi 2339 nukleotida mtdna manusia terhadap CRS ditunjukkan pada Gambar IV.5.
19 Gambar IV.5 Kumpulan data penjajaran variasi nukleotida terhadap CRS Baris pertama memuat kumpulan sampel sesuai kode aksesnya beserta informasi jumlah basa, jumlah variasi nukleotida beserta penjajaran terhadap setiap posisi variasi nukleotida terhadap CRS. Kolom pertama adalah urutan basa nukleotida CRS terhadap posisi mutasi, sedangkan kolom kedua adalah posisi varisi nukleotida 2339 sampel terhadap CRS. Sampel selanjutnya dikelompokkan berdasarkan panjang basanya. Kode titik pada basis data menunjukkan nukleotida yang sama antara sampel dengan CRS. Pada basis data ini diperlihatkan perbedaan nukleotida antara sampel dengan CRS pada seluruh posisi mutasi yang ditemukan pada 2339 sampel mtdna manusia. Nukleotida yang sama antara sampel dan CRS ditunjukkan dengan tanda titik, sedangkan nukleotida yang berbeda akan dituliskan pada posisi terjadinya mutasi tersebut.. IV.2 Analisa Variasi Nukleotida mtdna Manusia Setelah basis data variasi nukleotida mtdna manusia terhadap CRS selesai disusun, kemudian dilakukan sejumlah analisa variasi nukleotida mtdna manusia. Di antaranya adalah analisa distribusi posisi mutasi berdasarkan urutan nukleotida, distribusi mutasi terhadap gen pada mtdna manusia, dan posisi mutasi yang berhubungan dengan penyakit pada manusia.
20 IV.2.1 Analisa Variasi Nukleotida Berdasarkan Posisi Mutasi Analisa yang pertama dilakukan adalah mengamati jumlah mutasi yang ditemukan pada masing-masing sampel. Hal ini dilakukan untuk mengamati tingkat mutasi pada urutan nukleotida mtdna manusia, karena telah diketahui sebelumnya bahwa tingkat mutasi yang terjadi pada mtdna jauh lebih tinggi dibandingkan yang terjadi pada DNA inti (Wallace, 1992).. Kurva IV.2 Kurva jumlah mutasi pada sampel terhadap jumlah sampel Rentang jumlah variasi nukleotida terhadap CRS (mutasi) pada tiap sampel berkisar dari lima jumlah mutasi yang terkecil sampai 107 buah yang terbesar pada total 2339 sampel mtdna manusia yang digunakan dalam penelitian. Kurva IV.2 di atas menunjukkan bahwa jumlah variasi nukleotida (mutasi terhadap CRS) pada tiap sampel ternyata berkisar dari lima buah mutasi yang terkecil sampai dengan 107 jumlah mutasi yang terbesar dari total 2339 sampel mtdna manusia. Fakta ini menunjukkan bahwa meskipun telah diketahui sebelumnya bahwa tingkat mutasi pada mtdna mencapai sepuluh kali lebih
21 tinggi dibandingkan yang terjadi pada DNA inti, namun jumlah variasi nukleotida yang ditemukan pada tiap sampel hanya sekitar satu persen dari seluruh 16,5 kb pasang basa mtdna. Setelah diketahui bahwa ternyata hanya sebagian kecil fragmen mtdna yang mengalami mutasi, selanjutnya dilakukan analisa mengenai distribusi posisi mutasi-mutasi tersebut. Analisa ini diperlukan untuk menjawab pertanyaan apakah mutasi yang terjadi terpusat pada posisi-posisi tertentu ataukah terdistribusi merata di seluruh panjang 16,5 kb pasang basa mtdna. Kurva IV.3 Kurva posisi mutasi pada setiap 1000 nukleotida mtdna Sumbu x menunjukkan panjang 16,5 kb nukleotida mtdna yang dibagi tiap 1000 nukleotida, sedangkan sumbu y menunjukkan persentase terhadap seluruh 3998 posisi mutasi yang ditemukan pada 2339 sampel yang digunakan pada penelitian. Data mutasi dari 2339 sampel terhadap 3998 posisi variasi nukleotida menunjukkan profil distribusi mutasi pada umumnya tersebar secara merata. Pada masing-masing daerah yang dibagi menjadi 1000 nukleotida, ditemukan jumlah mutasi di bawah 11 persen dari total 3998 posisi mutasi yang ditemukan. Posisi basa nukleotida 1000 sampai dengan 3000 adalah daerah yang paling sedikit ditemukannya mutasi, yaitu masing-masing sekitar 3 persen dari total 3998 posisi
22 mutasi. Sedangkan daerah dengan tingkat mutasi paling tinggi adalah posisi basa nukleotida 0 sampai dengan 1000, dengan persentase mendekati 11 persen dari total 3998 posisi mutasi. Fragmen basa nukleotida 1000 sampai dengan 3000 merupakan daerah pengkode (coding region) dua unit RNA ribosom (sub unit kecil dan besar). Dua molekul ini sangat penting peranannya pada proses translasi, yaitu proses penerjemahan kode genetik dari DNA menjadi protein. Tidak adanya intron pada urutan nukleotida mtdna akan menyebabkan mutasi langsung tertuju pada daerah pengkode, sehingga mutasi yang terjadi pada fragmen basa nukleotida 1000 sampai dengan 3000 memiliki probabilitas yang tinggi mengganggu jalannya proses translasi akibat dari berubahnya struktur RNA ribosom. Seperti yang ditunjukkan pada penelitian sebelumnya yang menemukan bahwa mutasi pada 12s rrna mtdna dapat menyebabkan perubahan struktur sekunder dan memicu gangguan pendengaran (Ballana et al., 2006). Ternyata hasil analisa menunjukkan pada daerah ini probabilitas terjadinya mutasi paling rendah dibandingkan dengan fragmen lainnya. Daerah yang mengalami mutasi tertinggi adalah daerah yang tidak mengkode protein ataupun RNA struktural (non coding region), D-Loop. Mutasi pada mtdna yang menyandi protein serta RNA dapat menyebabkan meningkatnya kesalahan transfer elektron pada proses fosforilasi oksidatif. Kesalahan ini akan memicu terjadinya mutasi lebih lanjut sehingga mtdna menjadi rusak, tidak dapat direplikasi dan akhirnya didegradasi oleh sel melalui proses apoptosis. Mutasi pada daerah pengkode mtdna dapat menyebabkan terhambatnya pembentukan protein dan berperan pada terjadinya sejumlah penyakit pada manusia. Sedangkan mutasi yang tidak mempengaruhi kondisi fisiologis disebut sebagai variasi normal (Marzuki et al., 1991). Mutasi pada daerah yang tidak mengkode, D-Loop, tidak berbahaya bagi kelestarian mtdna sehingga mutasi ini dapat diturunkan pada proses replikasi. Hal ini yang menjadi penyebab tingginya tingkat mutasi pada D-Loop serta rendahnya tingkat mutasi pada daerah pengkode mtdna manusia. Setelah diperoleh gambaran mengenai distribusi mutasi berdasarkan fragmen tiap 1000 basa nukleotida, analisa selanjutnya adalah pengamatan persentase mutasi
23 pada masing-masing posisi mutasi terhadap seluruh 2339 sampel yang diteliti. Data posisi mutasi beserta peta genetik pada mtdna ditunjukkan pada Kurva IV.4. Kurva IV.4 Kurva persentase mutasi pada tiap posisi mutasi Diagram di samping kurva menunjukkan pembagian daerah mtdna berdasarkan fungsi genetiknya disertai penunjuk panjang mtdna dalam ukuran kilobasa (kb). Daerah berwarna kuning menunjukkan daerah pengkode protein, daerah hijau pengkode rrna, oranye pengkode trna, dan biru adalah non coding region.
24 Analisa kurva 3998 posisi mutasi terhadap 2339 total sampel mtdna manusia memperkuat hasil analisa sebelumnya pada kurva IV.3. Diperoleh sebaran distribusi mutasi yang merata di seluruh 16.5 kb nukleotida mtdna manusia. Pada umumnya tiap posisi mutasi ditemukan pada sekitar 10 persen dari seluruh sampel mtdna yang dianalisa. Fakta menarik dari kurva persentase mutasi tersebut adalah ditemukannya posisi-posisi mutasi yang ditemukan hampir di setiap sampel mtdna. Hal ini mengindikasikan urutan konsensus mtdna manusia seperti yang ditunjukkan pada hasil penelitian sebelumnya (Marzuki et al., 1991). Oleh karena itu, posisi mutasi dengan persentase di atas 50 kemudian dipisahkan dan diamati. Berdasarkan tabel data persentase mutasi pada tiap posisi, ditemukan fakta mengenai posisi konsensus mutasi mtdna manusia. Selanjutnya disusun urutan konsensus mtdna manusia yang memiliki perbedaan pada 13 basa nukleotida terhadap CRS. 13 posisi tersebut terdiri dari 11 posisi mutasi substitusi golongan transisi, satu posisi insersi dan satu posisi delesi. Berdasarkan informasi dari basis data MITOMAP, mutasi: G4985A, T11335C, dan 3107D adalah variasi yang disebabkan kesalahan pada proses penentuan urutan nukleotida CRS. Sedangkan mutasi: A8860G, A15326G, A4769G, A263G, A1438G, 310.1C adalah bentuk polimorfisme yang umum ditemukan pada mtdna manusia. Lima dari 13 posisi tersebut merupakan informasi baru urutan konsensus mtdna manusia, yang sebelumnya tidak ditemukan pada penelitian tahun 1991 menggunakan 13 buah sampel. Lima posisi tersebut yaitu: C7028T, A2706G, A73G, G11719A, T16519C. Informasi posisi nukleotida dengan persentase populasi tinggi dibandingkan terhadap CRS ditunjukkan pada Tabel IV.1, dan data lengkap urutan konsensus mtdna manusia yang disusun berdasarkan hasil penelitian ini ditampilkan pada Lampiran H.
25
26 Enam dari 13 posisi yang berbeda terhadap CRS tersebut terletak pada daerah pengkode. Perbedaan basa nukleotida pada suatu posisi daerah pengkode dapat menyebabkan perubahan terhadap asam amino yang ditranslasikan. Informasi perbedaan nukleotida dan asam amino antara urutan konsensus dan CRS ditunjukkan pada tabel IV.3 Tabel IV.2 Perbedaan asam amino CRS dan konsensus Empat posisi tidak mengalami perubahan asam amino, sedangkan dua posisi mengalami transisi asam amino treonin dan alanin. Posisi CRS Konsensus Daerah Pengkode Asam Amino 4769 Adenin Guanin ND2 Metionin 4985 Guanin Adenin ND2 Glutamin 7028 Sitosin Timin COI Alanin 8860 Adenin Guanin ATP6 Treonin Alanin 11719 Guanin Adenin ND4 Glisin 15326 Adenin Guanin CYB Alanin Treonin Tabel IV.2 menunjukkan bahwa 67% dari enam posisi yang berbeda pada daerah pengkode antara CRS dan urutan konsensus tidak menyebabkan perubahan asam amino yang dikode. Hal ini disebabkan perbedaan yang terjadi ada pada basa ketiga dari kodon pengkode asam amino. Fenotif tidak mengalami perubahan meskipun secara genetik ada perbedaan, fenomena ini disebut sebagai silent mutation. Dua posisi yang mengalami perbedaan asam amino yang dikode yaitu pada posisi 8860 daerah pengkode ATP6 dan posisi 15326 daerah pengkode sitokrom b, terjadi transisi asam amino alanin dan treonin. Dengan kata lain asam amino Treonin pada protein pengkode subunit ATP6 dan asam amino Alanin pada protein pengkode sitokrom b yang ditemukan pada CRS merupakan bentuk minor dibandingkan asam amino yang dikode oleh mtdna manusia pada umumnya.
27 IV.2.2 Analisa Variasi Nukleotida pada Gen mtdna Terakhir dilakukan analisa variasi nukleotida berdasarkan fragmen pada mtdna manusia yang memiliki fungsi genetik. Analisa pertama adalah pengamatan mutasi terhadap panjang atau ukuran gen. Kurva IV.5 Kurva persentase mutasi terhadap panjang gen pada mtdna manusia. Tanda kotak ( ) sebagai tanda gen pengkode rrna, tanda bintang ( ) adalah gen pengkode protein, tanda segitiga ( ) yaitu bukan pengkode, serta sisanya adalah gen pengkode trna. Diagram di bawah kurva menunjukkan pembagian daerah mtdna berdasarkan fungsi genetiknya disertai penunjuk panjang mtdna dalam ukuran kilobasa (kb). Daerah berwarna kuning menunjukkan daerah pengkode protein, daerah hijau pengkode rrna, oranye pengkode trna, dan biru bukan pengkode. Data pada Kurva IV.5 menunjukkan bahwa pada umumnya ditemukan posisi mutasi di bawah 10 persen dari seluruh panjang gen. Daerah dengan posisi mutasi tertinggi adalah daerah D-Loop. Akan tetapi, pada Kurva IV.5 diunjukkan sejumlah fragmen pada daerah pengkode yang juga menunjukkan tingkat mutasi yang cukup tinggi. Oleh karena itu dilakukan analisa jumlah mutasi yang terjadi pada D-Loop dan ATP8. ATP8 dipilih sebagai daerah pengkode yang mengalami tingkat mutasi paling tinggi, seperti yang ditampilkan pada Kurva IV.5. Hasil
28 analisa perbedaan distribusi mutasi daerah pengkode dan daerah bukan pengkode ditunjukkan pada Kurva IV.6. Kurva IV.6 Persentase jumlah mutasi daerah pengkode dan daerah bukan pengkode A. Jumlah mutasi pada daerah pengkode, ATP8. B. Jumlah mutasi pada daerah bukan pengkode, D-Loop. Variasi nukleotida paling banyak ditemukan pada daerah bukan pengkode dibandingkan pada daerah lainnya. Kurva IV.6 di atas menunjukkan distribusi persentase jumlah mutasi pada gen pengkode ATP8 dan D-Loop. Meskipun pada Kurva IV.5 ditunjukkan bahwa selain pada daerah D-Loop ternyata banyak posisi mutasi yang ditemukan pada daerah pengkode, tetapi jumlah variasi nukleotida tiap individu pada daerah D- Loop jauh lebih tinggi dibandingkan yang ditemukan pada daerah pengkode. Pada D-Loop terdapat daerah hipervariabel 1 (HV1) pada posisi 15.996-16.569 dan daerah hipervariabel 2 (HV2) pada posisi 1 618, dimana derajat keragaman pada daerah tersebut cukup tinggi di antara individu-individu yang tidak mempunyai kekerabatan maternal. Oleh karena itu daerah ini sangat cocok digunakan dalam studi filogenetik serta analisa forensik. Hal lain yang ditemukan dari hasil analisa ini yaitu sangat sedikit sampel yang mengalami mutasi pada daerah pengkode trna. Hal ini disebabkan panjang gen pengkode trna berukuran pendek yaitu sekitar 100 nukleotida, sehingga
29 kemungkinan untuk mengalami mutasi jauh lebih kecil dibandingkan fragmen lainnya yang berukuran lebih besar. Selain itu informasi dari basis data MITOMAP menunjukkan bahwa mutasi yang berhubungan dengan penyakit ternyata paling banyak ditemukan daerah pengkode trna. Molekul trna sangat esensial pada proses translasi untuk mengirim asam amino yang sesuai dengan pesan genetik pada molekul mrna. Kesalahan yang terjadi pada proses ini akan dapat menyebabkan kelainan struktur dan fungsi pada protein yang diproduksi. Protein pada mtdna sangat dibutuhkan bagi proses fosforilasi oksidatif (pembentukan ATP), maka mutasi yang terjadi akan memicu terjadinya disfungsi organ dan sejumlah penyakit pada manusia. Oleh karena itu, untuk mengamati distribusi mutasi yang berkaitan dengan penyakit, dilakukan analisa berikutnya. IV.2.3 Analisa Variasi Nukleotida yang Berhubungan dengan Penyakit Terakhir dilakukan analisa variasi nukleotida yang berhubungan dengan penyakit, ternyata dari 2339 sampel mtdna manusia yang digunakan dalam penelitian ini ditemukan dua individu mtdna yang ternyata mengalami mutasi basa Adenin menjadi Guanin pada posisi 8344, seperti yang ditunjukkan pada Gambar IV.6. Penelitian sebelumnya telah membuktikan bahwa mutasi A8344G pada trna Lys merupakan penyebab penyakit MERRF (Noer et al., 1991). Individu pertama yang diprediksikan sebagai pembawa cacat genetik penyebab penyakit MERRF tersebut adalah salah satu sampel mtdna yang digunakan dalam penelitian mengenai analisa filogenetik terhadap rekombinasi DNA mitokondria yang terjadi pada suatu keluarga yang mengalami heteroplasmi mtdna. (Zsurka et al., 2007). Individu kedua adalah salah satu sampel mtdna yang digunakan dalam penelitian mengenai variasi mtdna pada manusia berdasarkan seleksi alam. (Mishmar et al., 2003).
30 Gambar IV.6 Hasil penjajaran sebagai diagnosa penyakit genetik mtdna Ditunjukkan penjajaran sampel yang didiagnosa menderita penyakit MERRF karena mengalami mutasi basa Adenin menjadi Guanin pada posisi basa nukleotida 8344. Data posisi mutasi pada mtdna yang menyebabkan penyakit pada manusia serta jumlah individu yang didiagnosa menderita penyakit genetik selengkapnya ditunjukkan pada Tabel IV.3. Tabel IV.3 Jenis mutasi yang berhubungan dengan penyakit pada manusia. Pada tabel ini juga ditunjukkan jumlah individu dari 2339 sampel mtdna yang diduga menderita penyakit. Tanda bintang menandakan jenis penyakit yang disebabkan mutasi mtdna pada sel somatik CRS Posisi Mutasi Mutasi Penyakit Jumlah Sampel 1 2 3 4 5 T 146 T-C elderly fibroblasts* 387 C 150 C-T elderly fibroblasts* 311 T 152 T-C elderly fibroblasts* 619 A 189 A-G elderly muscle* 159 T 195 T-C elderly fibroblasts; lung cancer cells* 522 A 249 A-G elderly fibroblasts* 128 C 285 T-C elderly fibroblasts* 5 T 408 T-A elderly muscle* 9 T 460 T-A/C elderly Down's Syndrome fibroblasts* 2 A 606 A-G Myoglobinuria 3
31 Tabel 3 (Lanjutan) 1 2 3 4 5 T 1095 T-C SNHL 1 C 1310 C-T DM 8 A 1555 A-G DEAF 10 T 1738 T-C colorectal tumor 25 C 2835 C-T Rett Syndrome 5 G 3196 G-A ADPD 1 C 3243 C-G/T MELAS/DM/DMDF/CPEO(G), MM(T) 2 G 3254 G-G MM 3 T 3275 T-A LHON 1 T 3308 T-C MELAS 24 G 3316 G-A NIDDM; LHON; PEO 16 T 3394 T-C LHON; NIDDM 33 A 3397 A-G ADPD 5 G 3460 G-A LHON 4 G 3496 G-T LHON 6 A 4136 A-G LHON 2 T 4216 T-C LHON 187 A 4317 A-G FICP 2 C 4320 C-T Mitochondrial Encephalocardiomyopathy 1 T 4336 T-C ADPD 20 C 4640 C-A LHON 3 A 4917 A-G LHON 83 G 5460 G-A AD 177 T 5628 T-C CPEO 3 T 5814 T-C Mitochondrial Encephalopathy 8 G 7444 G-A LHON 14 A 7543 A-G MEPR 2 A 8296 A-G DMDF / MERRF/ HCM 3 A 8344 A-G MERRF 2 A 8348 A-G Cardiomyopathy 1 T 9101 T-C LHON 3 G 9438 G-A LHON 5 G 9738 G-T LHON 2 G 9804 G-A LHON 4 T 9949 G-A colorectal tumor 2 T 9957 T-C PEM; MELAS 1 T 9997 T-C MHCM 1 A 10044 A-G GER / SIDS 11 A 11084 A-G MELAS 39 G 11696 G-A LHON 7 G 11778 G-A LHON 4 A 12026 A-G DM 14 G 12192 G-A MICM 8 C 12246 C-G CIPO 2 G 12300 G-A lung carcinoma cybrid* 2
32 Tabel 3 (Lanjutan) 1 2 3 4 5 A 12308 A-G CPEO 224 T 12311 T-C CPEO 10 G 13513 G-A MELAS / Leigh Disease 3 G 13708 G-A LHON 144 G 14459 G-A LDYT / Leigh Disease 1 C 14482 C-A/G LHON 3 T 14484 T-C LHON 5 C 14568 C-T LHON 1 G 15257 G-A LHON 13 G 15498 G-A HCM 1 G 15812 G-A LHON 14 A 15924 A-G LIMM 79 T 16189 T-C Type 2 Diabetes; Cardiomyopathy 683 Sumber : MITOMAP (http://www.mitomap.org) Keterangan : LHON Leber Hereditary Optic Neuropathy MM Mitochondrial Myopathy AD Alzeimer's Disease LIMM Lethal Infantile Mitochondrial Myopathy ADPD Alzeimer's Disease and Parkinsons's Disease MMC Maternal Myopathy and Cardiomyopathy NARP Neurogenic muscle weakness, Ataxia, and Retinitis Pigmentosa;Leigh Disease FICP Fatal Infantile Cardiomyopathy Plus, a MELAS-associated cardiomyopathy MELAS Mitochondrial Encephalomyopathy, Lactic Acidosis, and Stroke-like episodes LDYT Leber's hereditary optic neuropathy and DYsTonia MERRF Myoclonic Epilepsy and Ragged Red Muscle Fibers MHCM Maternally inherited Hypertrophic CardioMyopathy CPEO Chronic Progressive External Ophthalmoplegia KSS Kearns Sayre Syndrome DM Diabetes Mellitus DMDF Diabetes Mellitus + DeaFness CIPO Chronic Intestinal Pseudoobstruction with myopathy DEAF Maternally inherited DEAFness or and Ophthalmoplegia aminoglycoside-induced DEAFness PEM Progressive encephalopathy SNHL SensoriNeural Hearing Loss Terdapat sejumlah variasi nukleotida (mutasi) yang terjadi pada mtdna yang ternyata berhubungan dengan penyakit genetik. Mutasi ini menimbulkan gangguan fungsi protein ataupun RNA struktural yang dikode oleh mtdna. Hal ini menyebabkan ATP yang diproduksi di dalam sel menjadi di bawah kadar minimum yang diperlukan oleh tubuh sehingga memicu munculnya sejumlah penyakit. Ditemukan sebanyak 66 posisi dari 3998 variasi nukleotida yang telah diketahui berhubungan dengan penyakit genetik tertentu. Hal ini berarti sekitar 98 persen variasi nukleotida yang terjadi pada mtdna manusia merupakan variasi normal, yaitu variasi yang tidak mempengaruhi kondisi fisiologis. Walaupun tingkat
33 mutasi pada mtdna sangat tinggi dan posisi mutasi spesifik sangat banyak ditemukan, tetapi pada umumnya mutasi-mutasi tersebut bersifat silent mutations, atau tidak menyebabkan penyakit. Posisi mutasi pada mtdna yang berhubungan dengan penyakit diperoleh dari basis data MITOMAP. Sejumlah penyakit akibat mutasi pada mtdna memungkinkan untuk diturunkan pada generasi berikutnya apabila penderita penyakit tersebut adalah wanita. Hal ini disebabkan tidak ada mitokondria pada sperma yang akan eksis pada saat fertilisasi sel telur, sehingga mtdna generasi berikutnya murni diturunkan dari ibu. Akan tetapi, terdapat sejumlah penyakit yang ternyata disebabkan oleh mutasi pada sel somatik Hal ini berarti hanya DNA mitokondria pada sel-sel otot saja yang mengalami mutasi sedangkan mtdna yang berada di jaringan lainnya tidak mengalami mutasi. Mutasi ini diperkirakan berlangsung pada saat proses pembelahan sel embrio menjadi sel otot. Sejumlah penyakit yang bersifat somatik tersebut ditunjukkan dengan tanda bintang pada Tabel IV.3. Salah satunya adalah penyakit yang dialami sejumlah individu dengan karakteristik otot yang mudah lelah ketika digunakan untuk beraktivitas. Penyakit somatik seperti ini tidak diturunkan kepada generasi berikutnya karena mutasi tidak terjadi pada sel reproduksi. Pada 2339 sampel yang digunakan pada penelitian ini ditemukan sejumlah individu yang didiagnosa menderita sejumlah penyakit yang diakibatkan mutasi pada mtdna. Penyakit dengan jumlah individu penderita tinggi diantaranya yaitu penyakit diabetes, serta gangguan saraf penglihatan dan otot. Di antara seluruh penyakit akibat mutasi mtdna, yang paling umum ditemukan adalah gangguan fungsi pada otot dan otak. Jaringan otot dan otak memerlukan pasokan energi yang lebih tinggi dibandingkan jaringan lainnya, sehingga menurunnya produksi ATP akibat mutasi pada mitokondria akan menyebabkan dua jaringan ini lebih rentan mengalami gangguan fungsional. Hal ini menunjukkan salah satu manfaat dari tersedianya basis data variasi nukleotida mtdna manusia sebagai sebuah standar referensi untuk.mendeteksi kemungkinan dideritanya suatu penyakit genetik. Terlebih lagi penyakit yang disebabkan cacat genetik pada mtdna mempunyai karakteristik mengalami
34 penundaan timbulnya gejala awal penyakit. Hal ini disebabkan kondisi heteroplasmi pada sel mitokondria yang terdiri dari mtdna normal dan mtdna mutan, sehingga masih terdapat sejumlah mtdna yang memproduksi ATP secara normal dan memberikan cukup pasokan energi bagi tubuh sampai dengan usia tertentu. Sampai pada akhirnya energi yang tersedia tidak mencukupi lagi untuk keperluan aktivitas jaringan tubuh yang terus menerus tumbuh dan berkembang. Pada kondisi seperti ini gejala penyakit akan mulai muncul. Proses degenerasi (penyusutan) maupun disfungsi organ yang terjadi akan bertambah parah dalam waktu yang singkat. Oleh karena itu, dengan tersedianya basis data referensi variasi nukleotida pada mtdna yang berhubungan dengan penyakit diharapkan diagnosa serta penanganan medis dapat dilakukan lebih dini.
Tabel IV.1 Perbandingan urutan mtdna CRS dan consensus 13 posisi nukleotida dengan persentase di atas 80% merupakan nukleotida penyusun urutan konsensus mtdna manusia Urutan Urutan Jenis Posisi Mutasi Sampel yang Persentase CRS Konsensus Mutasi Mengalami Mutasi G A Substitusi 4985 2338 99.95724669 A G Substitusi 8860 2334 99.78623343 T C Substitusi 11335 2334 99.78623343 A G Substitusi 15326 2333 99.74348012 A G Substitusi 4769 2326 99.44420693 A G Substitusi 263 2279 97.4348012 C - Delesi 3107 2274 97.22103463 A G Substitusi 1438 2256 96.45147499 - C Insersi 310.1 2081 88.96964515 C T Substitusi 7028 2025 86.5754596 A G Substitusi 2706 2006 85.76314664 A G Substitusi 73 1934 82.68490808 G A Substitusi 11719 1921 82.12911501 T C Substitusi 16519 1431 61.17999145 C T Substitusi 12705 1299 55.53655408 A G Substitusi 10398 1285 54.9380077 C T Substitusi 16223 1268 54.21120137 Total Sampel 2339