Ketrampilan Dasar Laboratorium Program Studi Ilmu Biomedik 2011 Kuliah 4: Oktober 5, 2010 Pengenceran revisited OpenWetWare file names Spektrofotometri Praktikum Metabolisme
Pengenceran: a:b Fishel, L.A. 2010. Dilution Confusion: Conventions for Defining a Dilution Journal of Chemical Education 87:183-1185. The ratio a:b is generally defined as the quotient (a/b) and is described as a in b. 2 4 However, it may also be expressed as a to b. 5,6 [meaning] the sum a+b. 2. Kaplan LA, Pesce AJ, eds. Clinical Chemistry: Theory, Analysis, Correlation. 5th ed. St Louis, Mo.: Mosby Elsevier; 2010:32. 3. Troy DB, ed. Remington The Science and Practice of Pharmacy. 21st ed. Philadelphia, Pa.: Lippincott Williams & Wil kins; 2006:119. 4. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, eds. Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. 4th ed. St. Louis, Mo.: Elsevier Saunders; 2006:27. 5. Darton M, Clark J. The Macmillan Dictionary of Measurement. New York, NY: Macmillan Publishing Co.; 1994:378. 6. The Random House Dictionary of the English Language. 2nd ed., unabridged. New York, NY: Random House; 1987: 1602.
Pengenceran: a:b Untuk mata kuliah Ketrampilan Dasar Laboratorium, a:b selalu diartikan a/a+b 1:1 pengenceran 50% atau 1/2 dari awalnya 1:3 pengenceran 25% atau 1/4 dari awalnya 2:3 pengenceran 40% atau 2/5 dari awalnya 1:9 pengenceran 10% atau 1/10 dari awalnya 1:10 pengenceran <10% atau 1/11 dari awalnya
Filenames in OpenWetWare Praktikum 4: Metabolisme I dan Spektrofotometri Bahan Praktikum Metabolisme I dan Spektrofotometri Artikel Dasar Kegiatan Praktikum Metabolisme di sini Tugas Mahasiswa (laporan) Praktikum 4 Tolonglah nama file Anda termasuk nama Anda/kelompok Anda sendiri Contoh: "Abdi dan Mustafa laporan praktikum metabolisme dan spektrofotometri.pdf??apakah email sudah sampai??
Spectrophotometry Basic Ideas: i) If a molecule absorbs a photon of electromagnetic radiation, its energy level will rise EXCITED STATE Energy Level Diagram ii) a molecule may vibrate in many ways, so there are many vibrational levels iii) Absorption (and emission) of energy is quantal (yaitu set values)
Basic ideas... iv) Electromagnetic Spectrum: relationship between energy and wavelength E = hc/ (h Planck s constant=4.13566733 10 15 ev s) UV and visible spectrum (~200-800nm) berguna bagi penelitian molekul-molekul electronic transitions X-ray or -ray energy tinggi molekul dihancurkan/kanker IR energi agak rendah mendapat keterangan tentang struktur molekul (rotational or vibrational transitions)
UV and visible spectrum (~200-800nm) λ semakin kecil energi semakin besar ** skala logarithmik** Ada molekul/unsur yang dapat menyerap cahaya langsung pada 200nm < λ > 800nm misalnya: DNA atau protein
Absorption Spectra of DNA and protein DNA and protein absorb energy in the UV region (DNA pada =260nm; protein pada =280nm)
Hasil Spektrofotometri DNA
serapan Spektra absorpsi glukosa dan kolesterol serapan glukosa kolesterol dasarnya: H 2 O 2 bereaksi dengan fenol, 4-amino-antipirin serta peroksidase derivatif kuinonimin yang berwarna merah. standar standar sempel sempel λ (nm) λ (nm) diambil dari: https://fscimage.fishersci.com/images/d10972~.pdf Enzymatic Colorimetric Methods for the Analysis of Human Serum by UV-Visible Spectroscopy, Keppy et.al., Thermo Fisher Scientific
serapan Protein dapat diukur dgn reagensia Biuret Serapan cahaya dibanding dengan panjang gelombang cahaya pada reaski reagensia Biuret dengan protein 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 Puncak serapan pada 520 nm 0 480 500 520 540 560 580 600 620 panjang gelombang (nm) data yg diperoleh pada praktikum BM506 2009
Alat Spektrofotometer : d hubungan antara transmisi cahaya (I/ I o ) dgn konsentrasi sempel log 10 (I o /I) = - dc % transmission = 100 x (I o /I) I o I o = intensitas cahaya yang masuk I = intensitas cahaya yang keluar d = jarak larutan yang dilalui cahaya (cm) c = konsentrasi larutan (mole/litre atau M) = molar absorption coefficient (M -1 cm -1 ) tapi lebih praktis untuk mengunakan konsep serapan (absorbance) dimana, A = -log 10 (I o /I) I A = dc
d I o = intensitas cahaya yang masuk I o A = -log 10 (I o /I) I I = intensitas cahaya yang keluar Kalau 0% cahaya diserap sempel?? I o = I A = -log 10 (1) A = 0 Kalau 50% cahaya diserap sempel?? I o > I A = -log 10 (2) A = 0,3 Kalau 99,9% cahaya diserap sempel?? I o >> I A = -log 10 (1000) A = 3
Kalau nilai A yang diperoleh > 1,5 sebaiknya sempel diencerkan dulu agar hasilnya lebih akurat/ dapat dipercaya 2 Hukum Beer-Lambert A = dc Hukum Beer-Lambert benar pada konsentrasi yang berbanding lurus dengan A
spektrofotometer Mode (transmittance or absorption) Cuvette holder On/Off Wavelength adjustment 100%T (0 absorbance) adjustment Basic operation: i) pakai sempel blanko dan sempel yg lain ii) sempel blanko dimasukkan dulu untuk dinulkan sinyal pada yg sedang digunakan iii) sempel yg lain diperiksa pada yg sama. iv)serapannya dibaca kuvet
Praktikum 4 Metabolisme I (glukosa, trigliserida, urea) dan Teknik Spektrofotometri Kelompok praktikum Bagian praktikum Pengenceran Grafik-grafik Laporan/Proposal Metabolisme II
Kelompok Praktikum Kelompok 1 (masuk pk 08:00): Dedy Ernawati Mara Imam Fera Roy Taufik Martina Lily Dorra Anwar Kelompok 2 (masuk pk 12:00): Taya Elsa Leo Yeni Dita Musthari Ningrum Donny Siti Sukaisi Grup praktikum ditentukan setiap hari praktikum 18
Cara kerja... 1. Pengenceran - doubling dilution dan decimal dilution dari larutan stok glukosa dan urea (meja 1,3,5 mengerjakan pengenceran larutan stok urea dan meja 2,4 mengerjakan pengenceran larutan stok glukosa) 2. Sempel darah diambil (boleh semua mhs, paling sedikit seorang dari grup meja Anda). 1ml darah cukup. 3. Darah disentrifugasi biar serum dapat diambil 4. Kerjakan pemeriksaan glukosa, trigliserida serta urea pada sempel serum sesuai dengan prosedurnya
Cara kerja... volume reagensia kit GLUKOSA TRIGLISERIDA UREA 1000 l reagensia glukosa 1000 l reagensia R2 1000 l reagensia A, kemudian 1000 l reagensia B volume sampel 10 l 10 l 10 l konsentrasi 100mg/dl 200mg/dl 40mg/dl standard kit periode dan 10 min @ 5 min @ 25 C temperatur 5 min @ 37 C 37 C ** 2X** inkubasi periksa pada λ 500nm 530nm 600nm
serapan Hasilnya... Tabel 1a s/d 2b faktor konsentrasi grup meja grup meja 1 2 4 8 16 32 64 128 blanko Hitung garis regresi (linear regression) pada data yg diperoleh. Rumus yang dihasilkan berbentuk y= mx + b dimana y = serapan; x = konsentrasi dan m merupakan slope konsentrasi
Hasilnya... Tabel 3 GLUKOSA UREA mhs: mhs: mhs: mhs: Serapan sempel dari grafik 1a/2a } dari grafik 1b/2b dari rumus kit contoh urea: A sempel /A standar x 40mg/dl maksudnya dari rumus garis regresi y= mx + b
serapan Hasilnya... Tabel 4 Hasil pemeriksaan glukosa, trigliserida dan urea plasma mahasiswa detil 2 mhs (berapa lama sejak makan; rata-rata apa yg dimakan; jenis kelaminan; umur) 1. GLUKOSA TRIGLISERIDA UREA A kadar A kadar A kadar 2. 3. data kelas
Laporan dan proposal Metabolisme II Laporan * satu laporan per grup meja 1-2 halaman selain Tabel 3 dan 5 grafik kata-kata sendiri perubahan yang ada dicatat 3 kesimpulan dari setiap grafik (5 grafik yang berdasar Tabel 1a, 1b, 2a, 2b serta Table 4) komentar atas kebuktian (atau tidak) Hukum Beer- Lambert komentar atas hasil pada Tabel 3. saran
Laporan dan proposal Metabolisme II Proposal untuk Praktikum Metabolisme II (dibuat masing-masing) Dari data dan pengalaman Anda pada praktikum ini, pikirkan suatu hipotesis dan mendesain suatu percobaan yang bisa membuktikan hipotesis Anda itu benar atau tidak dan yang bisa diuji dalam konteks praktikum (ingatlah keterbatasan waktu dan alat!!) Siapkan cara kerja/proposal yang lengkap dan jelas proposal akan dikumpulkan (secara hardcopy) pada UTS (tgl 10 Nopember) akan dikomentar dikembalikan kepada Anda sebelum akhir bulan Nopember. Anda boleh bergabung dengan seorang mhs lain (terserah Anda) sebagai grup meja untuk praktikum Metabolisme II dan boleh memilih satu proposal di antara kalian berdua untuk mengerjakan bersama-sama pada jam praktikum pada tgl 15 Desember 2011.
UTS Praktek Ketrampilan Praktikum Akan dilaksanakan pada Hari Kamis tgl 10 November pk 08:30 s/d selesai Bentuknya: per orang 45 menit 15 menit sempat membaca soal-soal 15 menit kegiatan praktek laboratorium 15 menit kegiatan praktek data analisis Bahan ujian: semua bahan kuliah & praktikum *diperbolehkan Anda bawa bahan praktikum atau catatan lain. Jangan lupa pengaris, pensil, penghapus, balpoin (pasti bertugas buat grafik! kertas grafik disediakan kami)
References: Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. & Walter, P. 2008. Molecular Biology of the Cell (5th ed), Garland Science, Taylor & Francis Group, New York. Southeastern Universities Research Association (www.sura.org) Dunn, S.M.J. 1990. PMCOL 306 Course Notes, University of Alberta Pharmacology Department Holme, D. J. & Peck, H. 1998. Analytical Biochemistry (3rd ed), Addison Wesley Longman Inc., New York.