III. METODE PENELITIAN A. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah kedelai, isolat protein kedelai, kedelai yang ditambahkan dekstrin, serta dua puluh produk minuman bubuk komersial berbasis kedelai, sedangkan bahan kimia yang digunakan untuk analisa oligosakarida adalah standar rafinosa (Sigma), standar stakiosa (Sigma), standar glukosa (Merck), standar sukrosa (Merck), standar fruktosa (Merck), heksana (Merck), etanol (Merck), air HPLC grade (Merck), acetonitril (Merck), gas N 2, iodin, KI, dan aquades. Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah HPLC Agylent yang dilengkapi dengan degasser (model G1322A Agilent), pompa solvent (model G1310A Agilent), dan detektor refractive index (model G1362A Agilent), kolom HPLC untuk karbohidrat (ZORBAX Carbohydrate Analysis Columns) berukuran 5 µm 4.6 mm 150 mm (Agilent), vacuum rotary evaporator, magnetic stirrer, kertas Whatman#41, membrane filter 0,45-µm nylon, erlenmeyer, buret, gelas piala, neraca analitik, pipet tetes, penjepit cawan (gegep), cawan porselen, tabung reaksi, penangas air, gelas ukur, labu takar 10 ml, labu takar 50 ml, labu takar 100 ml, desikator, dan oven tanur. B. Metode Penelitian Penelitian ini terdiri dari empat tahapan. Tahap pertama adalah persiapan sampel. Tahap kedua adalah melakukan validasi metode HPLC yang meliputi linieritas, penentuan limit of detection (LOD), penentuan limit of quantification (LOQ), dan penentuan persen recovery. Tahap ketiga adalah analisis kadar oligosakarida pada dua puluh minuman bubuk komersial berbasis kedelai dengan menggunakan metode HPLC dan tahap terakhir adalah analisis data. 1. Persiapan sampel Tahap awal dari persiapan sampel adalah mendata sebanyak-banyaknya minuman bubuk berbasis kedelai yang dijual di Indonesia. Tahap selanjutnya adalah mensurvei keberadaan produkproduk tersebut di pasaran. Survei dilakukan di Bogor, Semarang, dan Jakarta. Tahap selanjutnya adalah memilih sampel untuk penelitian hingga akhirnya terpilih dua puluh sampel. Sampel-sampel terpilih tersebut kemudian digolongkan berdasarkan usia konsumen, yaitu sampel yang ditujukan untuk konsumen diatas 3 tahun, untuk konsumen 1-3 tahun, dan untuk konsumen 0-1 tahun. Kedua puluh sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel minuman bubuk produksi PT Nutricia Indonesia Sejahtera (Indonesia), PT Nutrifood Indonesia (Indonesia), Abbott Laboratories B.V (Netherlands), Wyeth Nutritionals Ireland (Ireland), NBTY Manufacturing LLC (USA), PT Gizindo Mitra Sukses (Indonesia), Glisindo (Indonesia), CV Intan Alami (Indonesia), Dodo- Mis (Indonesia), IND Herbal (Indonesia), Soya Jaya Sentosa (Indonesia), Melilea (China), dan PT Amco Mandiri Pratama (Indonesia). Penggolongan sampel dilakukan dengan melihat target konsumen dari produk-produk tersebut, yaitu konsumen berusia diatas 3 tahun, 1-3 tahun, dan 0-1 tahun. Sampel yang ditujukan untuk usia 3 tahun ke atas dibagi lagi menjadi sampel minuman untuk konsumen golongan khusus dan konsumen biasa. Penggolongan menjadi konsumen golongan khusus dan konsumen biasa didasarkan pada komposisi bahan dan pernyataan pada label yang menyatakan bahwa produk ditujukan untuk konsumen golongan khusus. 11
2. Validasi metode HPLC a. Linearitas Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara langsung serta proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Linieritas dinyatakan sebagai koefisien korelasi dari kurva standar (Harmita, 2004). Menurut Epshtein (2004) pembuatan kurva standar dilakukan dengan membuat stock standar dengan konsentrasi tertentu. Kemudian dilakukan pengenceran untuk konsentrasi standar berikutnya, sehingga diperoleh deret standar dengan konsentrasi yang berbeda. Selanjutnya deret standar tersebut dianalisis sehingga didapat kurva hubungan konsentrasi dan respon detektor. Linieritas dinyatakan sebagai koefisien korelasi dari kurva standar. Menurut Papadoyanis dan Samanidou (2005), linieritas pada HPLC dapat ditentukan dengan melakukan tiga sampai enam kali injeksi pada lima atau lebih seri konsentrasi standar yang digunakan. Konsentrasi yang digunakan dapat berkisar antara 80-120% dari konsentrasi yang diharapkan, atau 50-150%, bahkan dapat dilakukan dengan 25-125%. b. Penentuan limit of detection (LOD) dan limit of quantification (LOQ) Limit of detection (LOD) atau batas deteksi merupakan konsentrasi terendah dari suatu analit yang masih dapat dideteksi, sedangkan limit of quantification (LOQ) atau batas kuantitas adalah konsentrasi terendah dari suatu analit yang dapat diukur secara tepat dan teliti (Jenke, 2005). Menurut Epshtein (2004) LOD merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan, sedangkan LOQ merupakan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. LOD dan LOQ dapat diukur berdasarkan nilai standar deviasi dari konsentrasi terendah. c. Penentuan persen recovery Penentuan persen recovery bertujuan untuk mengetahui berapa banyak komponen yang dianalisis dapat hilang akibat proses preparasi, sehingga dapat menyatakan keakuratan metode yang digunakan. Semakin besar persen recovery, artinya semakin sedikit komponen yang hilang akibat preparasi yang dilakukan sehingga hasil yang diperoleh lebih akurat. Menurut Epshtein (2004) penentuan persen recovery dapat dilakukan dengan menambahkan sejumlah tertentu analit ke dalam sampel kemudian diperiksa dengan menggunakan metode analisis. Hasil tersebut kemudian dibandingkan dengan hasil analisis tanpa penambahan analit. Persen recovery dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. 3. Ekstraksi oligosakarida Analisis oligosakarida dilakukan pada 20 produk minuman bubuk komersial berbasis kedelai. Selain itu dilakukan juga simulasi analisis oligosakarida pada bahan utama yang biasa digunakan pada produk-produk komersial, yaitu bubuk kedelai, isolat protein kedelai, serta bubuk kedelai yang ditambahkan dekstrin komersial. Pengujian pada 20 produk komersial dilakukan pada dua batch produksi yang berbeda dengan dua kali ulangan. Hasil analisis tersebut kemudian dibandingkan dan dianalisis dengan menggunakan uji independent t-test pada program SPSS untuk mengetahui hasilnya berbeda nyata atau tidak. Ekstraksi oligosakarida dilakukan dengan menggunakan metode Wang et al. (2007), yaitu dengan mengekstrak komponen gula sederhana pada sampel dengan larutan etanol 70%, yang sebelumnya dilakukan penghilangan lemak dengan menggunakan heksana. Komponen gula sederhana 12
tersebut berupa monosakarida, disakarida, dan oligosakarida. Ekstrasi dengan etanol 70% dilakukan pada suhu 70 o C selama 1 jam, kemudian hasil ekstrak tersebut dianalisis dengan menggunakan HPLC. 4. Analisis HPLC Oligosakarida tepung kedelai yang telah diisolasi kemudian dianalisis dengan menggunakan HPLC. HPLC yang digunakan dilengkapi dengan peralatan sebagai berikut : 1. degasser (model G1322A Agilent), pompa solvent (model G1310A Agilent), dan detektor refractive index (model G1362A Agilent). 2. Kolom (ZORBAX Carbohydrate Analysis Columns) berukuran 5 µm 4.6 mm 150 mm yang dilapisi dengan 3-aminopropylsilane pada partikel silica. 3. Fase gerak yang digunakan adalah campuran dari acetonitrile dan air (75:25) dengan kecepatan aliran 1.5 ml/menit. 4. Standar pada pengujian oligosakarida adalah rafinosa dan stakiosa dari Sigma, serta standar gula sederhana berupa fruktosa, glukosa, dan sukrosa dari Merck. 5. Uji kualitatif dekstrin Uji kulitatif dekstrin dilakukan untuk mengetahui secara kualitatif apakah terdapat komponen dekstrin pada sampel. Hal ini dilakukan karena diduga terdapat beberapa sampel yang menambahkan dekstrin pada produknya namun tidak menyebutkannya dalam komposisi produk. Sampel yang mengandung dekstrin atau diduga mengandung dekstrin akan menghasilkan peak rafinosa yang besar sehingga dibutuhkan perhitungan tertentu untuk mengetahui komponen rafinosa yang sesungguhnya. 6. Perhitungan kadar rafinosa pada sampel yang mengandung dekstrin atau diduga mengandung dekstrin Sampel yang mengandung dekstrin adalah sampel yang pada label kemasan mencantumkan dekstrin/maltodekstrin sebagai komposisinya, sedangkan sampel yang diduga mengandung dekstrin adalah sampel yang pada label kemasan tidak mencantumkan dekstrin/meltodekstrin sebagai komposisinya, namun berdasarkan uji kualitatif dekstrin dan hasil pembacaan HPLC diperoleh adanya kandungan dekstrin didalamnya. Pada sampel yang mengandung dekstrin atau diduga mengandung dekstrin, kadar rafinosa yang diperoleh sangat besar, hal ini dikarenakan adanya kandungan dekstrin yang memiliki berat molekul yang sama dengan rafinosa sehingga menutupi peak rafinosa ketika dianalisis dengan HPLC. Oleh karena itu diperlukan perhitungan untuk menduga kadar rafinosa yang ada pada sampel tanpa pengaruh dari komponen dekstrin. 7. Analisis data Analisis data dilakukan menggunakan SPSS 17.0. Uji yang dilakukan adalah independent t- test (Uji t) untuk kandungan rafinosa dan stakiosa pada sampel. Uji t dilakukan untuk mengetahui apakah ada perbedaan nyata antara data batch I dan II. Uji lainnya adalah one way ANOVA dan uji lanjut Duncan untuk mengetahui apakah ada perbedaan nyata antar kelompok sampel dan antar sampel dalam satu kelompok. 13
C. Prosedur Analisis 1. Linearitas (Epshtein, 2004) Menurut Epshtein (2004) penentuan linearitas dapat dilakukan dengan enam konsentrasi yang berbeda. Standar yang digunakan adalah rafinosa dan stakiosa. Penentuan konsentrasi standar dilakukan berdasarkan keterangan pada panduan penggunaan kolom HPLC. Keterangan tersebut menunjukkan kemampuan kolom dalam membaca standar. Konsentrasi standar rafinosa yang digunakan adalah 8.66 mg/ml sedangkan pada standar stakiosa sebesar 8.77 mg/ml. Konsentrasi tersebut kemudian dilakukan pengenceran sehingga diperoleh enam seri konsentarsi standar. Larutan stock rafinosa dibuat dengan menimbang sebanyak 8.66 mg standar rafinosa kemudian ditepatkan dalam labu takar 10 ml dengan larutan acetoniril:air (1:1). Larutan stock stakiosa dibuat dengan dengan menimbang sebanyak 8.77 mg standar stakiosa kemudian ditepatkan dalam labu takar 10 ml dengan larutan acetoniril:air (1:1). Larutan stock tersebut kemudian dilakukan pengenceran dengan perbandingan 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, dan 3:1 dengan larutan acetoniril:air (1:1) untuk membuat seri pengenceran pada standar rafinosa dan stakiosa. Sebanyak 20 µl larutan dari setiap seri pengenceran standar dianalisis dengan HPLC dengan tiga kali ulangan untuk setiap konsentrasi. Linearitas ditentukan menggunakan metode regresi kuadrat linear dari kurva hubungan luas area dengan konsentrasi standar. Persamaan linearitas yang digunakan adalah y = a + bx dengan y merupakan luas area dan x merupakan konsentrasi standar. 2. Penentuan LOD dan LOQ (Epshtein, 2004) Penentuan LOD dan LOQ dilakukan dengan mengukur respon detektor terhadap konsentrasi terendah sebanyak tujuh kali ulangan, kemudian ditentukan standar deviasi dari ulangan tersebut dan dilakukan perhitungan LOD dengan persamaan (2.1) dan LOQ dengan persamaan (2.2). LOD = 3 x standar deviasi LOQ = 10 x standar deviasi (2.1) (2.2) 3. Penentuan persen recovery (Epshtein, 2004) Menurut Epshtein (2004) penentuan persen recovery dapat dilakukan dengan menambahkan sejumlah tertentu analit ke dalam sampel kemudian diperiksa dengan menggunakan metode analisis. Sebanyak 15 mg standar rafinosa dan 14 mg standar stakiosa ditambahkan ke dalam 2 gram isolat protein kedelai. Sampel tersebut kemudian dilakukan ekstraksi oligosakarida dan dianalisis dengan menggunakan HPLC. Selanjutnya persen recovery ditentukan dengan persamaan (3.1). 100% (3.1) Keterangan : A = konsentrasi standar pada sampel yang ditambahkan standar (mg/g) B = konsentrasi standar pada sampel tanpa penambahan standar (mg/g) C = konsentrasi standar yang ditambahkan (mg/g) 4. Analisis kadar air metode oven (AOAC Official Method. 925.10, 2005) Cawan aluminium kosong dikeringkan dalam oven suhu 105 o C selama 15 menit lalu didinginkan dalam desikator selama 5 menit atau sampai tidak panas lagi. Cawan ditimbang dan dicatat beratnya. Sejumlah sampel (1 gram) dimasukkan ke dalam cawan kosong yang telah diketahui 14
beratnya. Cawan beserta isi dikeringkan di dalam oven bersuhu 105 0 C. Pengeringan dilakukan sampai diperoleh bobot konstan. Setelah dikeringkan, cawan dan isinya didinginkan di dalam desikator, ditimbang berat akhirnya, dan dihitung kadar airnya dengan persamaan (4.1). % 100% (4.1) Keterangan : x = berat cawan dan sampel sebelum dikeringkan (g) y = berat cawan dan sampel setelah dikeringkan (g) a = berat cawan kosong (g) 5. Ekstraksi oligosakarida (Wang et al., 2007) Sebanyak 2 gram tepung kedelai dihilangkan lemaknya dengan penambahan heksana, kemudian saring dengan kertas Whatman#41. Residu secara kuantitatif dipindahkan ke dalam gelas piala. Oligosakarida diekstrak dengan menambahkan 20 ml etanol 70%, kemudian dipanaskan pada suhu 70 o C selama 1 jam dalam waterbath shaker. Setelah itu dilakukan sentrifuse selama 30 menit pada 2400 rpm. Supernatan hasil sentrifuse diambil sebanyak 5 ml dan dihembuskan dengan N 2 untuk menghilangkan etanol. Kemudian ditambahkan 0.5 ml larutan acetonitrile-air (1:1) dan disaring dengan membrane filter 0,45 µm sebelum diinjeksi pada HPLC. Proses ekstraksi oligosakarida pada sampel dapat dilihat pada Gambar 3. 2 g tepung kedelai + 20 ml heksana Pengadukan dengan magnetic stirrer selama 3 jam Penyaringan dengan kertas Whatman#41 Pemindahan residu secara kuantitatif ke dalam gelas piala Penambahkan 20 ml etanol 70%, panaskan pada suhu 70 o C selama 1 jam Sentrifuse 30 menit pada 2400 rpm Pemindahan 5 ml supernatan ke dalam vial tertutup Penghilangan etanol dengan dihembus gas N 2 Penambahan 0.5 ml acetonitrile:air (1:1) Penyaringan dengan membrane filter nylon 0,45 µm sebelum diinjek pada HPLC Gambar 3. Diagram alir ekstraksi oligosakarida kedelai 15
6. Uji kualitatif dekstrin (SNI 01-2593 1992) Uji kualitatif dekstrin dilakukan dengan uji warna pada larutan lugol sesuai dengan SNI 01-2593 1992 tentang dekstrin pada industri pangan. Warna yang terjadi tergantung dari komposisi dekstrin. Pada umumnya akan menghasilkan warna ungu kecoklat-coklatan. Larutan lugol dibuat dengan menimbang 50 g iodin (I 2 ) dan 100 g KI. Kemudian dilarutkan dalam 100 ml air suling. Setelah larut diencerkan menjadi 1000 ml. Sebanyak 0.5 g contoh dimasukkan ke dalam erlenmeyer 100 ml. Kemudian ditambah 25 ml air suling dan ditetesi dengan larutan lugol, dan diamati perubahan warna yang terjadi. 7. Perhitungan kadar rafinosa pada sampel yang mengandung dekstrin atau diduga mengandung dekstrin Perhitungan dilakukan dengan menggunakan perbandingan rafinosa dan stakiosa pada bahan baku yang digunakan yaitu kedelai atau isolat protein kedelai. Peak stakiosa pada pembacaan HPLC tidak terpengaruh dengan adanya komponen dekstrin, sehingga dapat digunakan untuk menduga kandungan rafinosa yang tertutupi oleh dekstrin. Hal ini dilakukan dengan asumsi perbandingan rafinosa dan stakiosa dari kedelai atau isolat protein kedelai adalah tetap. Perhitungan kadar rafinosa pada sampel dilakukan dengan persamaan (7.1). (7.1) Keterangan : = kadar rafinosa kedelai atau isolat protein kedelai (mg/g) = kadar stakiosa kedelai atau isolat protein kedelai (mg/g) = kadar stakiosa sampel (mg/g) 8. Perhitungan konsentrasi gula sederhana (Drenthe, 2004) Gula sederhana seperti fruktosa, glukosa, dan sukrosa pada sampel kedelai atau minuman bubuk berbasis kedelai dapat dihitung berdasarkan perbandingan luas area dan konsentrasi standar gula. Sejumlah tertentu standar gula seperti fruktosa (15 mg), glukosa (57 mg), dan sukrosa (57 mg) dilarutkan dengan larutan acetonitril:air (1:1) ke dalam labu takar 10 ml, kemudian injeksikan ke dalam HPLC untuk melihat luas area yang diperoleh. Luas area tersebut kemudian dibandingkan dengan luas area pada sampel untuk memperoleh konsentrasi gula pada sampel. Menurut Drenthe (2004), menghitung konsentrasi suatu komponen pada sampel dengan menggunakan perbandingan luas area suatu kromatografi dapat dilakukan dengan persamaan (8.1). (8.1) Keterangan: = konsentrasi sampel (mg/l) = konsentrasi standar (mg/l) = luas area pada sampel (nriu.s) = luas area pada standar (nriu.s) 16