9 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Rumah Kaca Cikabayan, University Farm, Institut Pertanian Bogor (IPB) dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian IPB mulai bulan April sampai Agustus 2011. Metode Penelitian Penelitian terdiri atas dua kegiatan, yaitu (1) Evaluasi respons lima varietas tanaman kacang panjang terhadap BCMV, dan (2) Uji efisiensi kutudaun menularkan BCMV. Perbanyakan Inokulum BCMV Isolat BCMV yang digunakan adalah isolat asal Cirebon yang diperoleh dari Laboratorium Virologi, Departemen Proteksi Tanaman IPB. Inokulum diperbanyak pada tanaman kacang panjang varietas Parade, yang memiliki respons sangat rentan terhadap BCMV (Damayanti dan Suryadi 2008). Metode yang digunakan dalam perbanyakan inokulum virus adalah menularkan virus secara mekanis pada tanaman kacang panjang yang berumur satu minggu setelah tanam (MST). Cairan perasan tanaman (sap) dibuat dengan cara menggerus daun muda yang terinfeksi virus sebanyak 0,5 g dalam 0,01 M bufer fosfat (ph 7) yang mengandung merkapto etanol 2% dengan perbandingan 1:10 (b/v). Sap tersebut dioleskan pada permukaan daun yang sudah ditaburi dengan carborundum 600 mesh. Permukaan daun yang sudah diberi perlakuan dibilas menggunakan air destilata yang mengalir. Penanaman Tanaman Uji Tanaman kacang panjang yang digunakan dalam penelitian terdiri atas lima varietas yaitu Parade, New Jaliteng, Long Silk, Super Sainan, dan Pilar. Masing-masing varietas memiliki sifat agronomi yang berbeda (Lampiran 1-5). Benih kacang panjang yang sehat ditanam pada polybag berukuran 35 x 35 cm dan 10 x 10 cm yang sudah berisi tanah dan pupuk kandang dengan perbandingan 2:1. Setiap polybag ditanami tiga benih dengan kedalaman 2 cm.
10 Pada umur satu MST, dilakukan penyiangan dan pemilihan satu bibit terbaik untuk tahapan selanjutnya. Pemeliharaan tanaman dilakukan dengan menyiram tanaman setiap hari hingga siap untuk pengujian respons ketahanan terhadap BCMV. Inokulasi BCMV pada Lima Varietas Kacang Panjang Metode inokulasi yang dilakukan dalam pengujian respons lima varietas kacang panjang adalah metode mekanis mengikuti tahapan yang diuraikan sebelumnya pada bagian perbanyakan inokulum BCMV. Setelah inokulasi tanaman dipelihara di rumah kaca. Pengamatan dilakukan terhadap periode inkubasi penyakit, kejadian penyakit, keparahan penyakit, waktu pembungaan, jumlah bunga, dan bobot polong/tanaman. Deteksi virus dilakukan menggunakan metode Indirect ELISA. Identifikasi Kutudaun Kutudaun diperoleh dari pertanaman kacang panjang di Desa Bubulak, Kecamatan Bogor Barat, Kabupaten Bogor. Identifikasi dilakukan berdasarkan buku identifikasi Blackman dan Eastop (2000), yaitu menggunakan kutudaun yang tidak bersayap. Karakter yang diamati terdiri dari kepala, abdomen, sifunkuli, kauda, dan antena. Sebelumnya dipersiapkan terlebih dahulu preparat kutudaun mengikuti metode Mound (2006). Kutudaun dimasukan ke dalam tabung reaksi yang berisi 5 ml alkohol 95% kemudian tabung dipanaskan dalam penangas air selama 5 menit. Setelah dipanaskan isi tabung dituangkan pada cawan sirakus, kemudian kutudaun ditusuk dengan jarum. Kutudaun selanjutnya dimasukan kembali ke dalam tabung reaksi yang berisi KOH 10% dan dipanaskan hingga terlihat transparan. Tabung berisi kutudaun tersebut kemudian dituang kembali ke dalam cawan sirakus, dengan bantuan mikroskop dan jarum, isi tubuh kutudaun dikeluarkan dengan cara menekan tubuh serangga tersebut. Kutudaun selanjutnya dicuci dengan air destilata sebanyak dua kali. Perlakuan selanjutnya adalah dehidrasi kutudaun, dengan cara merendam kutudaun yang telah dibersihkan dengan air destilata dalam alkohol secara berurutan mulai dari tingkat kepekatan 50%, 80%, 95%, dan absolut 100%, masing-masing perendaman selama 10 menit. Kutudaun kemudian direndam dalam minyak cengkeh hingga berwarna coklat dan
11 selanjutnya diletakan di atas gelas obyek. Posisi kutudaun ditata hingga terlihat bagian-bagian tubuhnya, selanjutnya gelas obyek tersebut ditutup dengan gelas penutup. Sisa-sisa minyak cengkeh disekitar gelas penutup diserap menggunakan tisu hingga bersih, setelah itu dikeringkan di tabung pengering serangga. Setelah koleksi preparat serangga tersebut kering, kemudian bagian sisi gelas penutup diolesi dengan kutek agar tidak mudah rusak. Pemeliharaan dan Perbanyakan Kutudaun Kutudaun yang telah diidentifikasi sebagai A. craccivora dipelihara dan diperbanyak pada tanaman kacang panjang varietas Parade. Sebelumnya kutudaun dari lapangan dibebas viruskan terlebih dahulu pada tanaman talas (Colocasia esculenta (L.) Schott ) yang sehat dan sudah dicuci. Tangkai daun talas dibalut dengan kapas basah dan diletakan pada cawan petri. Kutudaun imago yang tidak bersayap dimasukan ke dalam cawan petri yang berisi daun talas menggunakan kuas. Cawan petri ditutup dan imago kutudaun dibiarkan melahirkan nimfa pada daun talas. Kutudaun pada stadia nimfa tersebut dipindahkan ke tanaman kacang panjang sehat dan dibiarkan berkembang biak untuk digunakan pada tahapan penularan BCMV dengan serangga vektor. Penularan BCMV melalui Serangga Vektor Kutudaun Kutudaun yang digunakan adalah stadia imago. Kutudaun dipindahkan dari tanaman kacang panjang ke dalam cawan petri untuk diberikan periode puasa selama 30 menit. Kutudaun kemudian dipindahkan ke tanaman kacang panjang sakit dan diberikan periode makan akuisisi (pma) selama 5 menit. Setelah melewatkan pma, kutudaun dipindahkan ke tanaman kacang panjang sehat varietas Parade untuk diberikan periode makan inokulasi (pmi) selama 30 menit. Pada tahap pmi jumlah serangga yang dipindahkan adalah 1 ekor/tanaman, 3 ekor/tanaman, 5 ekor/tanaman, 7 ekor/tanaman, dan 10 ekor/tanaman. Perlakuan untuk tanaman kontrol sama dengan tanaman yang diuji, tetapi kutudaun yang digunakan diberikan periode makan akuisisi pada tanaman kacang panjang sehat atau tidak terinfeksi BCMV. Pengamatan dilakukan selama empat minggu setelah pmi, mencakup kejadian penyakit, dan titer virus. Deteksi virus dilakukan menggunakan metode Indirect-ELISA.
12 Deteksi Virus Metode yang dilakukan untuk deteksi virus adalah metode ELISA tidak langsung (indirect-elisa), menggunakan antiserum Potyvirus (Agdia, USA). Deteksi virus dilakukan pada minggu ke-2 dan ke-4 setelah inokulasi. Tahap ELISA diawali dengan penyiapan sap sebagai antigen. Sap disiapkan dengan menggerus tanaman sakit menggunakan mortar dengan extraction buffer ph 9,6 [1,59 g Na 2 CO 5 ; 2,93 g NaHCO 3 ; 0,20 g NaN 3 ; 20 g PVP yang dilarutkan dalam 1 l air destilata] dengan perbandingan 1:100 (v/v). Sebanyak 100 µl sap diisikan ke dalam sumuran ELISA. Plat diinkubasi semalam pada suhu 4 0 C, setelah itu plat dicuci sebanyak tujuh kali dengan PBST (Phosphate buffer saline tween 20). Tiap sumuran kemudian diisi dengan 100 µl antiserum BCMV (1:200). Plat diinkubasi kembali pada suhu ruang 24 0 C selama dua jam, kemudian plat dicuci sebanyak delapan kali dengan PBST. Sumuran plat selanjutnya diisi 100 µl enzim konjugat RaM-AP (Goat anti-rabbit yang telah dilabel enzim Alkaline phosphate) dalam conjugate buffer dan diinkubasi selama satu jam pada suhu ruang 24 0 C. Plat kemudian dicuci dengan PBST sebanyak delapan kali. Setiap sumuran diisi kembali dengan 100 µl substrat PNP (Pnitrophenylphosphate) (1 tablet PNP dalam 5 ml PNP buffer) dan diinkubasi selam 30-60 menit pada suhu ruang. Perubahan warna diamati pada masingmasing sumuran. Apabila warna telah berubah menjadi kuning, reaksi segera dihentikan dengan menambahkan 50 µl NaOH 3M. Hasil ELISA dianalisis secara kuantitatif dengan ELISA reader (BIO-RAD Model 550) pada panjang gelombang 405 nm. Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL). Data yang diperoleh dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA) dengan taraf nyata (α) = 5%. Pengaruh perlakuan yang berbeda nyata dilakukan uji lanjut dengan uji selang berganda Duncan (DMRT) dengan taraf nyata 5%. Data diolah dengan program Statistical Analysis System (SAS) versi 9.1.3. Pada pengujian respons varietas kacang panjang, perlakuan terdiri atas lima varietas yaitu Parade, New Jaliteng, Long Silk, Super Sainan, dan Pilar. Setiap varietas tanaman diulang sebanyak sepuluh kali, untuk masing-masing
13 varietas terdapat kontrol dengan sepuluh ulangan, sehingga jumlah tanaman dalam pengujian inokulasi BCMV pada tanaman kacang panjang adalah 100 tanaman. Pada pengujian penularan BCMV melalui serangga vektor kutudaun, perlakuan terdiri atas jumlah serangga/tanaman yaitu 1 ekor/tanaman, 3 ekor/tanaman, 5 ekor/tanaman, 7 ekor/tanaman, dan 10 ekor/tanaman dengan lima ulangan dan setiap perlakuan terdapat kontrol dengan jumlah yang sama yaitu lima ulangan, sehingga jumlah tanaman yang diuji sebanyak 50 tanaman. Parameter Pengamatan 1). Persentase kejadian penyakit dihitung dengan rumus : Keterangan : KP = Kejadian Penyakit (% tanaman bergejala) n = Tanaman bergejala N = Jumlah tanaman yang diamati/diinokulasi 2). Persentase keparahan penyakit dihitung dengan rumus : Keterangan : P = Tingkat kerusakan n = Jumlah bagian tanaman yang diamati pada kategori serangan (daun, bunga, polong). v = Nilai kategori serangan Z = Nilai skala kategori serangan tertinggi N= Jumlah seluruh bagian yang diamati (daun, bunga, polong) Skala kategori serangan penyakit yang digunakan adalah sebagai berikut (Gambar 3): Skor 0 = Tanaman tidak bergejala Skor 1 = Gejala mosaik ringan dengan pemucatan tulang daun Skor 2 = Gejala mosaik sedang Skor 3 = Gejala mosaik berat Skor 4 = Malformasi daun (kerdil atau mati)
14 a b c d e Gambar 3 Skala kategori serangan penyakit (a) skor 0; (b) skor 1; (c) skor 2; (d) skor 3; (e) skor 4. 3). Periode inkubasi virus dalam tanaman adalah waktu timbulnya gejala, dari mulai inokulasi sampai terlihat gejala pertama. 4). Masa pembungaan, diamati pada saat bunga pertama kali muncul (bakal bunga); jumlah bunga yang muncul dihitung sampai empat minggu setelah masa berbunga. 5). Bobot polong/tanaman dihitung mulai dari kacang panjang siap panen yaitu pada saat tanaman berumur 60 70 hari. Polong yang tepat untuk dipanen yaitu berwarna hijau segar dan polongnya masih padat. Tanaman kacang panjang dapat dipanen beberapa kali, dengan interval panen dilakukan seminggu sekali berjalan sampai masa produktif terhenti atau setelah tanaman berumur sekitar 4 bulan.