BAB III BAHAN DAN METODE 3.1. Tempat dan Waktu Penelitian 3.1.1. Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Perikanan dan Kelautan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran. 3.1.2. Waktu Penelitian Persiapan penelitian dilaksanakan pada bulan Maret 2013 dan kegiatan penelitian utama dilaksanakan pada bulan April Mei 2013. 3.2. Alat dan Bahan Penelitian 3.2.1. Alat Penelitian a. Peremajaan Biakan dan Kultur Padat - Cawan petri untuk tempat kultur padat. - Inkubator untuk melakukan inkubasi. - Autoklaf untuk melakukan sterilisasi menggunakan tekanan uap. - Hot plate untuk memanaskan medium. - Spatula untuk mengambil bubuk Nutrient Agar (NA). - Erlenmeyer untuk menyimpan medium. - Magnetic Stirrer untuk menghomogenkan medium. - Rak tabung reaksi untuk menyimpan tabung reaksi. - Gelas ukur untuk mengukur volume larutan. - Bunsen untuk mencegah kontaminasi saat pemurnian bakteri. - Jarum ose untuk melakukan pemindahan bakteri. - Tabung reaksi untuk menyimpan stock bakteri. b. Aktivasi Selulolitik - Cawan petri untuk tempat medium dan pengujian - Jarum ose untuk memindahkan isolat murni ke cawan petri yang berisi medium. - Inkubator untuk menginkubasi bakteri. 28
29 - Hot Plate untuk memanaskan medium - Bunsen untuk mencegah kontaminasi saat memindahkan bakteri. - Gelas ukur untuk mengukur volume larutan. c. Analisis Molekuler dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) 1. Kultur Cair - Erlenmeyer sebagai tempat untuk menyimpan medium. - Tabung reaksi sebagai tempat pembiakan bakteri pada tahap kultur cair. - Jarum ose untuk memindahkan biakan bakteri. - Bunsen untuk mencegah kontaminasi saat pemindahan bakteri. - Shaker Incubator untuk inkubasi bakteri. 2. Isolasi DNA - Rak microtube untuk menyimpan microtube. - Mikro pipet untuk mengambil larutan DNA dan larutan kimia. - Centrifuge untuk memisahkan larutan. - Microtube untuk menyimpan ekstrak DNA. - Timbangan analitik untuk menimbang bobot sampel. - Waterbath untuk inkubasi ekstrak DNA. - Vortex untuk menghomogenkan larutan. 3. Polymerase Chain Reaction (PCR) - Thermal cycler untuk melakukan amplifikasi DNA. - Microtube untuk wadah komponen PCR. 4. Elektroforesis Gel Agarose - Gelas ukur untuk mengukur volume larutan Tris Borat EDTA (TBE). - Timbangan analitik untuk menimbang agarose. - Cetakan gel agarose (sisir) untuk mencetak gel agarose dan membuat sumur-sumur untuk penempatan hasil ekstraksi. - Hot Plate dan Magnetic Stirrer untuk memanaskan campuran pada pembuatan larutan agarosa. - Sendok pipih untuk memindahkan gel agarose. - Alat elektroforesis untuk memisahkan pita DNA dengan bantuan arus listrik.
30 - Power supply untuk penyalur arus listrik. - Ultraviolet Transilluminator untuk melihat hasil akhir elektroforesis. 3.2.2. Bahan Penelitian a. Peremajaan Biakan dan Kultur Padat - Isolat Bakteri Bacillus subtilis dan Bacillus thuringiensis - Medium Nutrient Agar (NA) - Air laut steril - Alkohol 70% - Kapas - Kain kasa - Plastik - Plastik wrap - Alumunium foil - Kertas label b. Aktivasi Selulolitik - Medium Nutrient Agar (NA) - Air Laut Steril - CMC (Carboxy Methyl Celullose) - Red congo 0,1% - Deionized water - NaCl 1M - Plastik wrap - Kertas label - Kapas - Kain kasa - Plastik
31 c. Analisis Secara Molekuler 1. Kultur Cair - Nutrient Broth (NB) - Air Laut Steril 2. Isolasi DNA - Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega - Isopropanol (Suhu Ruang) - Etanol 70% (Suhu Ruang) - Lysozyme 10 mg/l 3. Amplifikasi Gen Endoglukanase - DNA template - PCR Master Mix (KAPA2G Fast Ready Mix PCR Kit) - Primer Forward F Primer3 Bacillus subtilis - Primer Reverse R Primer3 Bacillus subtilis - Primer Forward F Primer Degenerate Bacillus thuringiensis - Primer Reverse R Primer Degenerate Bacillus thuringiensis - Nuclease Free Water 4. Elektroforesis - Gel agarose - Larutan pemberat dan pewarna (Loading dye) - Larutan Tris Borat EDTA (TBE) - Ethidium Bromide (EtBr) - DNA Ladder 1 kb (Biolabs) - Akuades
32 3.3. Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode eksploratif dan data yang diperoleh akan dianalisis secara deskriptif. Adapun alur penelitian disajikan sebagai berikut: Peremajaan Biakan dan Kultur Padat Uji Aktivitas Selulolitik Desain Primer Gen Pengkode Endoglukanase Penapisan Gen Pengkode Endoglukanase Menggunakan Metode PCR Analisis Bioinformatik Gambar 10. Diagram Alir Penelitian 3.4. Prosedur Penelitian 3.4.1. Sterilisasi Alat dan Medium Sebelum melakukan isolasi ataupun pemurnian bakteri, perlu dilakukan sterilisasi alat guna mencegah kontaminasi dari alat ataupun medium yang digunakan. Pada penelitian ini teknik sterilisasi yang digunakan adalah sterilisasi uap dengan menggunakan autoklaf. Sterilisasi uap dengan autoklaf dilakukan dengan menyimpan alat atau medium yang akan digunakan didalam autoklaf, lalu autoklaf dinyalakan hingga mencapai suhu 121ºC, kemudian dibiarkan selama 15 menit untuk membunuh kontaminan yang kemungkinan dapat mengkontaminasi alat ataupun medium. Tekanan pada autoklaf yaitu 1 atm (Hadioetomo 1993).
33 3.4.2. Peremajaan Biakan dan Kultur Padat Peremajaan biakan dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu: - Bubuk Nutrient Agar (NA) ditimbang dengan timbangan digital sebanyak 7 gr. - Air laut steril dimasukkan ke dalam beaker glass sebanyak 250 ml. - Bubuk Nutrient Agar (NA) dan air laut dimasukkan ke dalam erlenmeyer. - Erlenmeyer ditutup menggunakan kain kasa dan kapas. - Medium dididihkan menggunakan Hot Plate. - Medium disterilkan menggunakan autoklaf - Agar dituang ke dalam cawan petri hingga memadat - Bakteri yang akan diremajakan diambil menggunakan jarum ose. - Bakteri yang telah diambil dipindahkan ke tabung reaksi yang berisi medium Nutrient Agar (NA) menggunakan metode gores zigzag. - Tabung reaksi ditutup menggunakan kain kasa dan kapas. - Disimpan dalam inkubator dengan suhu 30ºC selama 3x24 jam. - Isolat bakteri dimasukkan ke dalam kulkas. Kultur padat dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu: - Bakteri yang akan dikultur diambil menggunakan jarum ose. - Bakteri yang telah diambil dipindahkan ke cawan petri yang berisi medium Nutrient Agar (NA) menggunakan metode gores. - Cawan petri ditutup dan dilapisi dengan plastik wrap. - Disimpan dalam inkubator dengan suhu 30ºC selama 2 x 24 jam. 3.4.3. Uji Aktivitas Selulolitik Setelah dilakukan kultur padat lalu dilakukan uji aktivitas selulolitik. Uji skrining ini dilakukan pada media Nutrient Agar (NA) dan air laut dengan tambahan CMC 1% dari volume Nutrient Agar (NA). Pada pengujian ini dilihat zona bening yang dihasilkan.
34 Pengujian ini dilakukan melalui beberapa tahapan, yaitu: - Bubuk Nutrient Agar (NA) ditimbang dengan timbangan digital sebanyak 7 gr. - Bubuk CMC 1% ditimbang dengan timbangan digital sebanyak 0,07 gr. - Air laut steril dimasukkan ke dalam beaker glass sebanyak 250 ml. - Bubuk Nutrient Agar (NA), CMC 1%, dan air laut dimasukkan ke dalam erlenmeyer. - Erlenmeyer ditutup menggunakan kain kasa dan kapas. - Medium dididihkan menggunakan Hot Plate. - Medium disterilkan menggunakan autoklaf. - Medium ditiriskan pada suhu ruang. - Bakteri yang ada pada isolat tunggal diambil menggunakan jarum ose. - Bakteri dipindahkan menggunakan jarum ose ke dalam cawan petri yang berisi medium (Nutrient Agar (NA) + air laut) + CMC 1%. - Kultivasi bakteri dilakukan selama 1 x 24 jam. - Setelah bakteri tumbuh, pewarna red congo konsentrasi 0,5 % dituangkan ke dalam cawan petri hingga medium terendam. - Perendaman dengan red congo dilakukan selama 15 menit. - Red congo dibuang. - Dilakukan perendaman kembali menggunakan NaCl 1M selama 15 menit. - NaCl 1M dibuang. - Diamati dan diukur luasan zona bening yang dihasilkan. Zona bening tersebut merupakan respon dari isolat bakteri B.subtilis dan B.thuringiensis terhadap CMC yang ditambahkan dalam medium NA. Pengujian aktivitas selulolitik dilakukan untuk mengetahui enzim endoglukanase yang dihasilkan oleh bakteri B.subtilis dan B.thuringiensis. Kedua sampel tersebut kemudian dilanjutkan dengan identifikasi molekuler. Rumus menghitung indeks selulolitik : rata-rata diameter zona bening Indeks selulolitik (IS) rata-rata diameter koloni
35 3.4.4 Teknik Molekuler dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Bioinformatik Teknik molekuler digunakan untuk mengisolasi gen pengkode enzim endoglukonase dengan menggunakan desain primer. Setelah itu, dikarakterisasi secara In Silico. Adapun tahapan penelitian yang dilakukan meliputi : a. Persiapan bakteri menggunakan kultur cair Sebelum melakukan isolasi DNA genom dari bakteri, dilakukan kultur cair untuk perbanyakan bakteri dengan tahapan sebagai berikut: - Bubuk Nutrient Broth (NB) ditimbang dengan timbangan digital sebanyak 6,5 gr. - Air laut steril dimasukkan ke dalam beaker glass sebanyak 500 ml. - Bubuk Nutrient Broth (NB) dan air laut dimasukkan ke dalam erlenmeyer. - Erlenmeyer ditutup menggunakan kain kasa dan kapas. - Medium dididihkan menggunakan Hot Plate. - Medium disterilkan menggunakan autoklaf. - Medium ditiriskan pada suhu ruang. - Diambil bakteri B.subtilis dan B.thuringiensis yang ada pada isolat tunggal menggunakan jarum ose. - Bakteri dipindahkan menggunakan jarum ose ke dalam tabung reaksi yang berisi medium Nutrient Broth (NB) + air laut steril - Isolat bakteri dihomogenkan menggunakan vortex. - Dilakukan inkubasi selama 24 jam dengan suhu 37ºC. b. Isolasi DNA genom bakteri DNA genom bakteri diisolasi menggunakan Wizard Genomic Purification Kit Promega, sebagai berikut: - Bakteri hasil kultur cair dipindahkan ke dalam tabung ependorf 1,5 ml dan dilakukan sentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 13.000 16.000 rpm dengan microcentrifuge. - Diambil pellet DNA dari hasil sentrifugasi.
36 - Ditambahkan larutan 50 mm EDTA sebanyak 480 μl ke dalam setiap tabung. - Ditambahkan larutan Lyzosyme sebanyak 120 μl lalu dicampurkan dengan cara membolak-balik tabung beberapa kali. - Dilakukan inkubasi sampel pada suhu 37 0 C selama 30 60 menit. Kemudian, disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 13.000 16.000 rpm dan supernatannya dibuang. - Didiamkan selama 1 menit sebelum dibuka untuk membuat larutan turun kembali ke dasar. - Setelah itu dilakukan penambahan larutan Nuclei Lysis Solution sebanyak 600 μl. - Tabung dibolak-balik sebanyak 2 kali sehingga DNA bakteri tercampur. - Dilakukan inkubasi pada suhu 80 0 C selama 5 menit untuk melisiskan bakteri. - Ditambahkan larutan RNase Solution sebanyak 3 μl lalu dicampurkan dengan cara membolak-balik tabung sebanyak 2-5 kali. - Dilakukan inkubasi pada suhu 37 0 C selama 15 60 menit lalu didinginkan pada suhu ruang selama 5 menit. - Ditambahkan larutan Protein Precipitation Solution sebanyak 200 µl dan dicampurkan dengan menggunakan vortex selama 20 detik. - Dilakukan inkubasi on ice selama 5 menit. - Dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 16.000 rpm selama 3 menit dalam microcentrifuge. - Supernatan dipindahkan ke dalam tabung ependorf 1,5 ml yang baru sebanyak 600 µl. - Dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 16.000 rpm selama 2 menit dan supernatan dibuang. Endapan DNA terlihat di dasar tabung yang disebut pellet DNA - Ditambahkan larutan ethanol 70% sebanyak 600µl. - Dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 16.000 rpm selama 2 menit dan supernatan dibuang.
37 - pellet DNA dikeringkan selama 10 15 menit. - Ditambahkan larutan DNA Rehydration Solution sebanyak 100 µl untuk mengawetkan pellet DNA. - Hasil isolasi DNA genom disimpan pada suhu 2-8ºC. c. Desain Primer Primer B.subtilis (Lampiran 1) didesain dengan menggunakan program Primer3 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) dengan database sekuen gen endoglukanase dari beberapa strain B.subtilis yang diunduh dari NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), sedangkan primer B.thuringiensis (Lampiran 2) didesain menggunakan program primer degenerate (CODEHOP ) (http://blocks.fhcrc.org/blocks/process_blocks.html) dengan database sekuen gen endoglukanase dari beberapa strain B.thuringiensis yang diunduh dari NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Rancangan primer spesifik dan primer degenerate (Lampiran 1 dan 2) dipesan melalui jasa pemesan sekuen primer 1st Base Singapore dengan kantor cabang PT. Genetika Science Indonesia. d. Penapisan Gen Endoglukanase Menggunakan Metode PCR Penapisan gen endoglukanase dilakukan dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk mendapatkan sekuen gen pengkode enzim endoglukanase yang akan digunakan sebagai bahan sekuensing. Primer gen endoglukanase yang digunakan untuk bakteri B.subtilis (Lampiran 3) yaitu hasil desain primer spesifik program Primer3, sedangkan primer gen endoglukanase yang digunakan untuk bakteri B.thuringiensis (Lampiran 3) yaitu hasil desain primer degenerate program CODEHOP dengan urutan sekuen primer masing-masing tercantum dalam Tabel 7 dan 8 di Bab IV.
38 Formulasi campuran reaksi PCR yang digunakan pada proses penapisan gen disajikan dalam (Tabel 3) dibawah ini : Tabel 3. Komponen Reaksi PCR Komponen PCR Konsentrasi Akhir Volume (µl) Deionized water / Nuclease free - water 8 2x KAPA2G Fast Ready Mix 1x 12,5 Primer forward 0,5 µm 1,25 Primer reverse 0,5 µm 1,25 DNA template - 2 Volume Total 25 Pengaturan program PCR untuk tahap denaturasi, annealing, elongasi, final elongasi, dan final hold pada template bakteri B.subtilis dan B.thuringiensis disajikan dalam (Tabel 4) dibawah ini : Tabel 4. Pengaturan Program PCR Siklus Suhu Waktu Jumlah Siklus Inisialisasi 94 C 2 menit 1 - Denaturasi - Annealing - Elongasi 94 C 60 C *), 55 C **) 72 C 30 detik 1 menit 2 menit Final elongasi 72 C 10 menit 1 Final hold 4 C - 1 Keterangan : *) Suhu Annealing Isolat Bakteri B.subtilis **) Suhu Annealing Isolat Bakteri B.thuringiensis 30 e. Elektroforesis Elektroforesis merupakan teknik pemisahan molekular berdasarkan atas ukurannya menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul.
39 Tahapan untuk melakukan elektroforesis sebagai berikut: 1. Persiapan Elektroforesis - Dibuat gel agarose (konsentrasi 1%) yaitu dengan cara diambil serbuk agarose sebanyak 0,5 gr dan dilarutkan pada 0,5x TBE buffer sebanyak 50 ml. - Dipanaskan di atas hot plate pada suhu ± 50 0 C hingga bening. - Setelah bening, gel didiamkan hingga terasa hangat. - Gel yang masih dalam keadaan cair dituang ke atas lempeng (plate). - Ditancapkan sisir ke dalam trays pencetak agar sebelum memadat. - Sisir dicabut saat gel agarose telah memadat. - Dimasukkan gel agarose yang telah padat ke dalam chamber elektroforesis yang berisi buffer TBE. 2. Pelaksanaan Elektroforesis - Dimasukkan hasil amplifikasi DNA, marker dan sampel DNA uji pada setiap sumur (well). - Ditutup chamber elektroforesis dan diberikan aliran listrik dengan cara menyambungkan kabel-kabelnya ke stop kontak. - Sisi yang berisi hasil amplifikasi diberi arus negatif. Besarnya arus elektroforesis tidak boleh melebihi 75 volt selama 70 menit. - Setelah selesai, dilakukan perendaman dengan Ethidium Bromide (EtBr) selama 10-15 menit. - Dilakukan perendaman kembali dengan akuades. - Setelah selesai, gel diangkat dengan menggunakan spatula dan ditiriskan. DNA Ladder 1 kb (Biolabs) terdiri dari fragmen mulai dari 500 bp sampai 10.000 bp, digunakan sebagai pembanding panjang fragmen. Amplifikasi PCR menggunakan program Primer3 untuk isolat bakteri B.subtilis diharapkan menghasilkan amplikon berukuran 1415 bp dan primer degenerate untuk isolat bakteri B.thuringiensis diharapkan menghasilkan amplikon berukuran 1250 bp.
40 3.4.5. Service Sekuensing Amplikon hasil PCR kemudian dikirimkan ke 1st Base, Inc. (Singapore) untuk disekuensing. Hasil sekuensing gen pengkode endoglukanase tersebut akan dikarakterisasi secara molekuler. 3.4.6 Karakterisasi Secara In Silico (Analisis Bioinformatik Sekuen Gen Endoglukanase) Setelah mendapatkan data hasil sekuensing, dilakukan karakterisasi gen endoglukanase secara In Silico meliputi : komparasi antara 2 sekuen gen endoglukanase yang didapat dari 2 isolat bakteri yang berbeda (pairwise alignment analysis) termasuk domain fungsional gen endoglukanase tersebut. 3.5. Analisis Data Data utama penelitian berupa sekuen gen endoglukanase hasil sekuensing yang diisolasi dari bakteri B.subtilis dan B.thuringiensis. Sekuen tersebut kemudian dianalisis lebih lanjut menggunakan program-program bioinformatik untuk mendapatkan data karakteristik protein yang meliputi : pensejajaran (alignment) sekuen dengan database sekuen gen endoglukanase di GeneBank (NCBI), analisis struktur domain fungsional, keberadaan sisi aktif, dan motif protein.