ISOLASI DAN KARAKTERISASI SENYAWA ANTIBAKTERI BACILLUS SUBTILIS T4 ISOLAT LAPANGAN Laporan Penelitian Oleh Dr. drh. Endang Endrakasih, MS PROGRAM STUDI PENYULUHAN PETERNAKAN JURUSAN PENYULUHAN PETERNAKAN SEKOLAH TINGGI PENYULUHAN PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
ABSTRAK ENDANG ENDRAKASIH. Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri Bacillus subtilis T4 Isolat Lapangan. Dibimbing oleh FACHRIYAN HASMI PASARIBU, I WAYAN TEGUH WIBAWAN dan BIBIANA W. LAY. Lebih dari seribu mikroorganisme yang termasuk bakteri, aktinomises, jamur dan protozoa mempunyai potensi untuk menghasilkan antibiotika. Jamur Penicillium notatum penghasil penisilin yang mencemari laboratorium Fleming tahun 1928 yang diduga sebagai pencemar asal udara dan galur-galur tertentu Bacillus subtilis juga menghasilkan antimikroba. Jamur dan bakteri ini berasal dari tanah. Tujuan penelitian ini adalah melakukan pengkajian senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh B. subtilis yang diisolasi dari susu sapi perah penderita mastitis subklinis. Pengkajian yang dilakukan meliputi produksi, spektrum hambatan, dan karakteristik senyawa antibakteri. Seleksi bakteri penghasil senyawa antibakteri dilakukan pada 120 isolat. Seleksi dilakukan dengan metode hambat langsung (direct inhibition method) dengan cara stab inoculation pada lernpeng agar darah. Bakteri indikator yang digunakan adalah Micrococcus luteus. Produksi senyawa antibakteri dilakukan pada media cair nutrient broth. Pemanenan dilakukan pada jam ke 18 inkubasi. Suhu inkubasi 37 C. Pemurnian dilakukan dengan metode presipitasi protein antibakteri dengan garam. Garam yang digunakan adalah amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan 90%. Protein antibakteri yang diperoleh kemudian difraksinasi dengan metode filtrasi gel modifikasi menggunakan Sephadex G 75 yang dipasang pada HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Sebagai fase gerak (mobile phase) digunakan Na2 HP0 4. Karakterisasi senyawa antibakteri dilakukan pada supernatan aktif dan protein murni. Karakterisasi yang dilakukan meliputi spektrum hambatan dengan metode difusi sumur, ketahanan terhadap suhu dan lama pemanasan, ph, enzim proteolitik, amilase, lipase, pelarut organik, serta bobot molekul. Hasil seleksi terhadap 120 isolat menunjukkan 9 isolat mempunyai aktivitas hambatan terhadap M. luteus dengan potensi yang bervariasi. Aktivitas hambatan paling tinggi ditunjukkan oleh isolat berkode T4. Setelah dilakukan identifikasi secara biokimiawi isolat ini adalah Bacillus subtilis, sehingga selanjutnya isolat ini disebut Bacillus subtilis T4. Senyawa antibakteri yang diproduksi oleh B. subtilis T4 ini menghambat M. luteus, Bacillus megaterium dan Salmonella enteritidis. Supernatan aktif yang berasal dari biakan B. subtilis T4 dengan kepadatan 10 5 /ml mampu menghambat M luteus dengan kepadatan 10 6 /ml. Daya hambat protein antibakteri terhadap M luteus dengan konsentrasi 10 6 /ml adalah 30 ug/ml untuk fraksi 1 dan 10 ug/ml untuk fraksi 2. Produksi protein antibakteri dimulai pada jam ke7 setelah inkubasi pada 37 C dan mencapai konsentrasi tertinggi pada jam ke 18. Supernatan aktif dan protein antibakteri murni tetap aktif pada pemanasan 50 C selama 20 menit, tahan pada ph 5-11, dapat diinaktivasi oleh enzim papain murni dan crude protease, tidak dapat diinaktivasi oleh enzim lipase, amilase, dan pelarut organik. Bobot Molekul (BM) protein antibakteri adalah 19,5 kda untuk fraksi 1 dan 36 kda untuk fraksi 2. i
ABSTRACT ENDANG ENDRAKASIH. Isolation and Characterization of the Antibacterial Substance Produced by Wild Isolate of Bacillus Subtilis T4. Under the direction of FACHRIYAN HASMI PASARIBU, I WAYAN TEGUH WIBAWAN and BIBIANA W. Lay. More than one thousand microorganisms including bacteria, actynomices, fungi, and protozoa have the potency to produce antibiotics. Penicillium notatum that produces penicillin and some strains of Bacillus subtilis are the examples of soil microorganisms that produced antimicrobe substances. This research might give a basic information in producing, isolating, and the characteristic of the antibacterial substance produced by B. subtilis from subclinical mastitis milk. One of one hundred and twenty isolates collected from subclinical mastitis milk was selected and studied. Selection method used was direct inhibition method with stab inoculation in blood agar plate. Micrococcus luteus was used as indicator bacteria. Antibacterial substance was produced by cultivating the chosen isolate in nutrient broth at 37 C for 18 hours. This culture was centrifuged and the supernatant obtained called as active supernatant. As the antibacterial substance was considered as protein, the antibacterial isolation method used was salt precipitation method using ammonium sulphate 90% w/v. The dried precipitate was then purified using modified gel filtration method set up in HPLC apparatus. Sephadex G 75 was used as stationary phase and NaH2P04 as mobile phase. Characterization was performed to study the effect of heat, ph, enzymes, and organic solvents on bacterial activity, inhibitory spectra, and the molecular weight of the antibacterial substance. Enzymes used were proteolytic, glucolytic, and lipolytic enzymes. Nine of 120 isolates were able to inhibit the growth of M. luteus and one of them, namely isolate T4 had the greatest potency. This isolate was identified biochemically as Bacillus subtilis, so the isolate was then called Bacillus subtilis T4. The antibacterial substance produced by B. subtilis T4 was able to inhibit the growth of M. luteus, Bacillus megaterium, and Salmonella enteritidis. The active supernatant of 10 5 /ml B. subtilis suspension was able to inhibit the growth of 10 6 /ml M. luteus suspension, while 30 μg/ml of fraction 1 and 10 μg/ml of fraction 2 purified protein were able to inhibit the growth of 10 6 /ml M. luteus. The antibacterial substance was produced 7 hours after incubation at 37 C and optimum production obtained 18 hours after incubation at the same temperature. Both active supernatant and antibacterial protein were still active following heating process at 50 C for 20 minutes. The active supernatant and antibacterial protein were active at ph 5-11. Purified papain and crude protease were able to destroy the inhibitory activity. Molecular weight of the antibacterial protein was 19.5 kda ( fraction 1 ) and 36 kda (fraction 2). ii
PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala kasih dan karunia-nya sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan penelitian yang berjudul : Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri Bacillus Subtilis T4 Isolat Lapangan ini. Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada Ketua Sekolah Tinggi Penyuluhan Pertanian Bogor, Ir. M. Nazaruddin, MM. dan Kepala Unit Penelitian dan Pengabdian kepada masyarakat yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk melakukan eksplorasi potensi bakteriosin untuk kepentingan pengobatan. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada Bapak Agus Somantri S.Pd. (Laboratorium bakteriologi FKH IPB) yang telah banyak membantu penulis selama penelitian, Bapak Kosasih (Bagian Khromatografi Laboratorim Kimia Terpadu IPB) yang telah banyak memberikan kemudahan dan bantuan, Ibu Prof. Dr. Ir. Maggy T. dan Ibu Ika (Laboratorium Biokimia dan Mikrobiologi Pusat Penelitian Bioteknologi IPB) yang telah banyak membantu dan bahkan menyumbangkan beberapa enzim proteolitik kepada penulis, Ibu Iis dan Ibu Merry dari Laboratorium Biokimia FMIPA-IPB yang telah membantu sentrifugasi selama penelitian ini berlangsung. Ucapan terimakasih penulis sampaikan sampaikan kepada Dr. drh. Darminto sebagai kepala Balai Besar Penelitian Veteriner yang telah memberikan ijin dilaksanakannya sebagian penelitian ini di Laboratorium Mikrobiologi dan Balitvet Culture Collection dan kepada Ibu Sri Poernomo, B.Sc., ibu drh. Tati Aryanti, MS., ibu Tuti, ibu Emi dkk. Dari bagian perpustakaan Balitvet yang telah banyak membantu memberikan kemudahan dan bantuan kepada penulis. Eksplorasi terhadap bakteriosin (senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh mikroba) penting dilakukan mengingat keunggulan bakteriosin ini diantaranya : 1. Menjanjikan untuk mengatasi infeksi oleh bakteri yang resisten terhadap antibiotik sintetis, 2. Target bakterisidalnya spesifik, 3. Toksisitasnya rendah Semoga tulisan ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Mei 2013 Endang Endrakasih iii
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL. DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN v vi vii PENDAHULUAN Latar Belakang...... 1 Tujuan...... 3 Manfaat Penelitian...... 3 Hipotesis...... 4 TINJAUAN PUSTAKA Sejarah... 5 Definisi dan Klasifikasi Bakteriosin... 6 Biosintesis Bakteriosin... 7 Spektrum dan Mekanisme Kerja Bakteriosin... 10 Produksi dan Pemurnian Bakteriosin... 17 Karakterisasi Bakteriosin... 20 Potensi dan Aplikasi Bakteriosin... 23 BAHAN DAN METODE Bahan... 25 Alat... 26 Metode... 27 HASIL DAN PEMBAHASAN Seleksi Isolat Penghasil Senyawa Antibakteri... 33 Identifikasi Isolat 33 Produksi Senyawa Antibakteri.. 33 Karakterisasi Senyawa Antibakteri.. 35 KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan.. 45 Saran 45 DAFTAR PUSTAKA. 46 LAMPIRAN 56 iv
DAFTAR TABEL Halaman 1. Persentase isolat klinis Streptococcus pneumoniae yang resisten terhadap penisilin...... 2 2. Perbedaan bakteriosin dan antibiotik... 6 3. Efek biokimia bakteriosin Gram positif terhadap sel sensitif.... 12 4. Faktor-faktor yang mempengaruhi aktifitas senyawa antibakteri B. subtilis T4.... 37 5. Spektrum hambatan senyawa antibakteri B. subtilis T4 terhadap beberapa bakteri indikator.... 41 6. Komposisi asam amino protein antibakteri B. subtilis T4 43 v
DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Model hipotetis biosintesis dan ekskresi molekul pediocin AcH... 9 2. Mekanisme kerja molekul bakteriosin menembus membran sel...... 14 3. Hambatan pertumbuhan supernatan aktif B. subtilis T4 terhadap bakteri indikator M. luteus dari jam ke jam selama 24 Jam... 34 4. Kurva pertumbuhan dan perubahan ph suspensi B. subtilis T4.. 34 5. Berat molekul fraksi 1 dan 2 protein antibakteri B. subtilis T4 hasil fraksinasi dengan gel filtrasi modifikasi...... 36 6. Hambatan pertumbuhan fraksi protein antibakteri B. subtilis T4 terhadap M. luteus...... 36 7. Aktivitas hambatan supernatan aktif, fraksi 1 dan 2 protein antibakteri B. subtilis T4 pada ph 1-13... 39 8. Aktivitas hambatan supernatan aktif, fraksi 1 dan 2 protein antibakteri B. subtilis T4 akibat pengaruh enzim... 40 vi
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Jumlah amonium sulfat yang diperlukan untuk pengendapan protein pada berbagai tingkat kejenuhan... 57 2. Kandungan bahan dalam gel pemisah dan gel penahan untuk elektroforesis dengan SDS-PAGE. 58 3. Hasil identifikasi biokemis isolat T4.. 59 Untuk mendapatkan informasi lebih lengkap, silahkan menghubungi Sekretariat Website Contact Person : 087873183123 vii